[推荐]微生物与发酵工艺知识大全

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⒈ 培养基
　　种子培养基的原材料质量的控制类似于孢子培养基原材料质量的控制。种子培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸收和利用，营养成分要适当地丰富和完全，氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗壮并具有较强的活力。另一方面，培养基的营养成分要尽可能地和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，这样的种子一旦移入发酵罐后也能比较容易适应发酵罐的培养条件。发酵的目的是为了获得尽可能多的发酵产物，其培养基一般比较浓，而种子培养基以略稀薄为宜。种子培养基的pH值要比较稳定，以适合菌的生长和发育。pH值的变化会引起各种酶活力的改变，对菌丝形态和代谢途径影响很大。例如，种子培养基的pH值控制对四环素发酵有显著影响。

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⒉ 培养条件
　　种子培养应选择最适温度，前面已有叙述。培养过程中通气搅拌的控制很重要，各级种子罐或者同级种子罐的各个不同时期的需氧量不同，应区别控制，一般前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量。在青霉素生产的种子制备过程中，充足的通气量可以提高种子质量。例如，将通气充足和通气不足两种情况下得到的种子都接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但是，在土霉素发酵生产中，一级种子罐的通气量小一些却对发酵有利。通气搅拌不足可引起菌丝结团、菌丝粘壁等异常现象。生产过程中，有时种子培养会产生大量泡沫而影响正常的通气搅拌，此时应严格控制，甚至可考虑改变培养基配方，以减少发泡。
　　对青霉素生产的小罐种子，可采用补料工艺来提高种子质量，即在种子罐培养一定时间后，补入一定量的种子培养基，结果种子罐放罐体积增加，种子质量也有所提高，菌丝团明显减少，菌丝内积蓄物增多，菌丝粗壮，发酵单位增高。

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⒊ 种龄
　　种子培养时间称为种龄。在种子罐内，随着培养时间延长，菌体量逐渐增加。但是菌体繁殖到一定程度，由于营养物质消耗和代谢产物积累，菌体量不再继续增加，而是逐渐趋于老化。由于菌体在生长发育过程中，不同生长阶段的菌体的生理活性差别很大，接种种龄的控制就显得非常重要。在工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。此时的种子能很快适应环境，生长繁殖快，可大大缩短在发酵罐中的迟滞期（调整期），缩短在发酵罐中的非产物合成时间，提高发酵罐的利用率，节省动力消耗。如果种龄控制不适当，种龄过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及因菌体量过少而菌丝结团，引起异常发酵等等；而种龄过老的种子接入发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产能力衰退。在土霉素生产中，一级种子的种龄相差2～3 h，转入发酵罐后，菌体的代谢就会有明显的差异。
　　最适种龄因菌种不同而有很大的差异。细菌的种龄一般为7～24 h，霉菌种龄一般为16～50 h，放线菌种龄一般为21～64 h。同一菌种的不同罐批培养相同的时间，得到的种子质量也不完全一致，因此最适的种龄应通过多次试验，特别要根据本批种子质量来确定。

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⑵ 间歇灭菌　间歇灭菌即实消，是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备十分耐压，则可采用较高的温度，但必须注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的部位。有些设备也可采用SO2熏蒸灭菌，如葡萄酒发酵池、罐等。
　　⑶ 固体培养基灭菌　固体培养基也和液体培养基一样，要先蒸煮灭菌，但固体培养基呈粒状、片状或粉状，流动性差，不易翻动，吸水加热易成团，冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌机常用于酒厂、酱油厂。该设备能承受一定压力，装料后旋紧进出口盖，就如同密封容器。转鼓以0.5～1 r／min徐徐转动，培养基得到翻动，蒸汽沿轴中心通入加热培养基，达到一定温度后，进行保温灭菌。灭菌完毕用真空泵沿空心轴抽真空，转鼓内压力降低，培养基冷却。

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⒉ 影响培养基灭菌的因素
　　影响培养基灭菌的因素除了所污染杂菌的种类、数量、灭菌温度和时间外，培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。
　　⑴ 培养基成分　油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性，高浓度有机物会包于细胞的周围形成一层薄膜，影响热的传递，因此在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。例如，大肠杆菌在水中加热至60～65 ℃便死亡；在10％糖液中，需70 ℃ 4～6 min；在30％糖液中需70 ℃ 30 min。
　　低质量分数(1％～2％)的NaCl溶液对微生物有保护作用，随着质量分数的增加，保护作用减弱，当质量分数达8％～10％以上则减弱微生物的耐热性。
　　⑵ pH值　pH值对微生物的耐热性影响很大。pH值6.0～8.0，微生物最耐热；pH<6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。所以培养基pH值愈低，灭菌所需的时间愈短，见表5-4。

表5-4　pH值对灭菌时间的影响


　　⑶ 培养基中的颗粒　培养基中的颗粒小，灭菌容易；颗粒大，灭菌难。一般含有小于1 mm的颗粒对培养基灭菌影响不大，但颗粒大时，影响灭菌效果，应过滤除去。
　　⑷ 泡沫　培养基的泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。对易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。对有泡沫的培养基进行连续灭菌时更应注意

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⒊ 分批灭菌和连续灭菌比较
　　连续灭菌与分批灭菌比较具有很多优点，尤其是当生产规模大时，优点更为显著。主要体现在以下几方面：① 可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；② 发酵罐利用率高；③ 蒸汽负荷均衡；④ 采用板式换热器时，可节约大量能量；⑤ 适宜采用自动控制，劳动强度小。
　　但当培养基中含有固体颗粒或培养基有较多泡沫时，以采用分批灭菌为好，因为在这种情况下用连续灭菌容易导致灭菌不彻底。对于容积小的发酵罐，连续灭菌的优点不明显，而采用分批灭菌比较方便。

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培养基与设备、管道灭菌条件

　　⑴ 杀菌锅内灭菌　固体培养基灭菌蒸汽压力0.098 MPa，维持20～30 min；液体培养基灭菌蒸汽压力0.098 MPa，维持15～20 min；玻璃器皿及用具灭菌，压力0.098 MPa，30～60 min。
　　⑵ 种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌　从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147 MPa，维持45 min，灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过到达死角灭菌。灭菌完毕，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保持罐压0.098 MPa。
　　⑶ 空气总过滤器和分过滤器灭菌　排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.174 MPa灭菌2 h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。
　　⑷ 种子培养基实罐灭菌　从夹层通入蒸汽间接加热至80 ℃，再从取样管、进风管、接种管进蒸汽，进行直接加热，同时关闭夹层蒸汽进口阀门，升温至121 ℃，维持30 min。谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为110 ℃，维持10 min。
　　⑸ 发酵培养基实罐灭菌　从夹层或盘管进入蒸汽，间接加热至90 ℃，关闭夹层蒸汽，从取样管、进风管、放料管三路进蒸汽，直接加热至121 ℃，维持30 min。谷氨酸发酵培养基实罐灭菌为105 ℃，维持15 min。
　　⑹ 发酵培养基连续灭菌　一般培养基为130 ℃，维持5 min，谷氨酸发酵培养基为115 ℃ 6～8 min。
　　⑺ 消泡剂灭菌　直接加热至121 ℃，维持30 min。
　　⑻ 补料实罐灭菌　根据料液不同而异，淀粉料液为121 ℃，维持5 min。
　　⑼ 尿素溶液灭菌　105 ℃，维持5 min。

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第二节　空气的净化
　　空气(即大气)是一种气态物质的混合物，除氧和氮外，还含有惰性气体、二氧化碳和水蒸气等。此外，尚有悬浮在空气中的灰尘，主要由构成地壳的无机物质微粒、烟灰、植物的花粉以及种类繁多的细菌和其他微生物所组成。空气中常见的微生物大致有金黄色小球菌、产气杆菌等，见表5-5。
表5-5　空气中常见的微生物种类及其大小

　　空气中微生物的数量与环境有密切的关系。一般干燥寒冷的北方，空气中含微生物量较少，而潮湿温暖的南方空气中含微生物量较多，城市空气中的微生物含量比人口稀少的农村多，地平面空气微生物含量比高空多。
空气中的微生物是依附在尘埃上的，空气中的尘埃数与细菌数的关系如下式：
Y＝0.003x-2.6
式中　Y——空气中的微生物数量，个／m3；
x——空气中的尘埃颗粒数量，个／m3。

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空气净化的方法

　　各种不同的培养过程，鉴于其所用菌种的生长能力强弱、生长速度的快慢、培养周期的长短以及培养基中pH值差异，对空气灭菌的要求也不相同。所以，对空气灭菌的要求应根据具体情况而定，但一般仍可按10-3的染菌概率，即在1000次培养过程中，只允许一次是由于空气灭菌不彻底而造成染菌，致使培养过程失败。空气净化的方法大致有如下几种。
　　⒈ 热灭菌法
　　空气热灭菌法是基于加热后微生物体内的蛋白质(酶)热变性而得以实现。它与培养基的加热灭菌相比，虽都是用加热法把微生物杀死，但两者的本质是有区别的。
　　鉴于空气在进入培养系统之前，一般均需用压缩机压缩，提高压力，所以，空气热灭菌时所需的温度，就不必用蒸汽或其他载热体加热，而可直接利用空气压缩时的温度升高来实现。空气经压缩后温度能够升到200 ℃以上，保持一定时间后，便可实现干热杀菌。利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理对制备大量无菌空气具有特别的意义。但在实际应用时，对培养装置与空气压缩机的相对位置，连接压缩机与培养装置的管道的灭菌以及管道长度等问题都必须加以仔细考虑。
　　⒉ 静电除菌
　　近年来一些工厂已使用静电除尘器除去空气中的水雾、油雾、尘埃，同时也除去了空气中的微生物。
　　静电除菌是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。悬浮于空气中的微生物，其孢子大多数带有不同的电荷，没有带电荷的微粒进入高压静电场时都会被电离成带电微粒。但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除尘灭菌对很小的微粒效率较低。图5-2为静电除尘灭菌器的示意。

图5-2　静电除尘灭菌器示意
1—升压变压器；2—整流器；3—沉淀电极；4—电晕电极
　　⒊ 介质过滤除菌法
　　过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所含微生物，而取得无菌空气的方法。通过过滤除菌处理的空气可达到无菌，并有足够的压力和适宜的温度以供好氧培养过程之用。该法是目前广泛应用来获得大量无菌空气的常规方法。在空气的除菌方法中，介质过滤除菌生产中使用最多。

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空气的过滤除菌原理和介质

　　⒈ 空气过滤除菌原理
　　空气过滤所用介质的间隙一般大于微生物细胞颗粒，那么悬浮于空气中的微生物菌体何以能被过滤除去呢？当气流通过滤层时，基于滤层纤维的层层阻碍，迫使空气在流动过程中出现无数次改变气速大小和方向的绕流运动，从而导致微生物微粒与滤层纤维间产生撞击、拦截、布朗扩散、重力及静电引力等作用，从而把微生物微粒截留、捕集在纤维表面上，实现了过滤的目的。如图5-3为过滤除菌时各种除菌机理的示意。

图5-3　过滤除菌机理示意
　　⑴ 布朗扩散截留作用　直径很小的微粒在很慢的气流中能产生一种不规则的直线运动称为布朗扩散。布朗扩散的运动距离很短，在较大的气速、较大的纤维间隙中是不起作用的，但在很慢的气流速度和较小的纤维间隙中布朗扩散作用大大增加微粒与纤维的接触滞留机会。假设微粒扩散运动的距离为x，则离纤维表面距离小于或等于x的气流微粒都会因为扩散运动而与纤维接触，截留在纤维上。由于布朗扩散截留作用的存在，大大增加了纤维的截留效率。
　　⑵ 拦截截留作用　在一定条件下，空气速度是影响截留效率的重要参数，改变气流的流速就是改变微粒的运动惯性力。通过降低气流速度，可以使惯性截留作用接近于零，此时的气流流速称为临界气流速度。气流速度在临界速度以下，微粒不能因惯性截留于纤维上，截留效率显著下降，但实践证明，随着气流速度的继续下降，纤维对微粒的截留效率又回升，说明有另一种机理在起作用，这就是拦截截留作用。
　　因为微生物微粒直径很小，质量很轻，它随气流流动慢慢靠近纤维时，微粒所在主导气流流线受纤维所阻改变流动方向，绕过纤维前进，并在纤维的周边形成一层边界滞留区。滞留区的气流流速更慢，进到滞留区的微粒慢慢靠近和接触纤维而被黏附截留。拦截截留的截留效率与气流的雷诺数和微粒同纤维的直径比有关。
　　⑶ 惯性撞击截留作用　过滤器中的滤层交织着无数的纤维，并形成层层网格，随着纤维直径的减小和填充密度的增大，所形成的网格也就越细致、紧密，网格的层数也就越多，纤维间的间隙就越小。当含有微生物颗粒的空气通过滤层时，空气流仅能从纤维间的间隙通过，由于纤维纵横交错，层层叠叠，迫使空气流不断地改变它的运动方向和速度大小。鉴于微生物颗粒的惯性大于空气，因而当空气流遇阻而绕道前进时，微生物颗粒未能及时改变它的运动方向，其结果便将撞击纤维并被截留于纤维的表面。
　　惯性撞击截流作用的大小取决于颗粒的动能和纤维的阻力，其中尤以气流的流速显得更为重要。惯性力与气流流速成正比，当空气流速过低时惯性撞击截留作用很少，甚至接近于零；当空气的流速增大时，惯性撞击截留作用起主导作用。
　　⑷ 重力沉降作用　重力沉降起到一个稳定的分离作用，当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时微粒就沉降。就单一的重力沉降情况来看，大颗粒比小颗粒作用显著，对于小颗粒只有气流速度很慢才起作用。一般它是配合拦截截留作用而显现出来的，即在纤维的边界滞留区内微粒的沉降作用提高了拦截截留的效率。
　　⑸ 静电吸引作用　当具有一定速度的气流通过介质滤层时，由于摩擦会产生诱导电荷。当菌体所带的电荷与介质所带的电荷相反时，就会发生静电吸引作用。带电的微粒会受带异性电荷的物体所吸引而沉降。此外，表面吸附也归属于这个范畴，如活性炭的大部分过滤效能是表面吸附的作用。
　　在过滤除菌中，有时很难分辨上述各种机理各自所作贡献的大小。随着参数的变化，各种作用之间有着复杂的关系，目前还未能作准确的理论计算。一般认为惯性撞击截留、拦截截留和布朗运动截留的作用较大(见图5-4)，而重力和静电引力的作用则很小。

图5-4　利用直接拦截、惯性冲撞和布朗扩散作用除去液滴或颗粒的纤维工作原理