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6.生长因素 　　自养型微生物不依赖外源的有机质，只要用无机化合物就可以合成其全部细胞物质。大部分异养型微生物除了利用有机氮源外，也可以在无机氮源或其它矿物质的环境中生长，故称为“原养型”(prototrophic)微生物。但有些异养型微生物由于失去了（或从未有过）合成一种和多种组成细胞所必需的有机化合物的能力，因此，必须由外源供应这些有机化合物生长。通常将这些物质统称为生长因素，其中包括氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶及它们的衍生物、脂肪酸及其它膜成分。缺乏合成生长因素能力的微生物称为“营养缺陷型”（auxotrophic）微生物。 一些微生物对生长因素的要求见表3-14。 表3-14　一些微生物对生长因素的要求

必须注意，各种微生物所需要的生长因素是不同的，有的需要多种，有的仅需一种，有的则不需要。而且，一种微生物所需要的外源生长因素不是固定不变的，它会随条件的变化而变化。这些主要条件主要指培养基的化学组成（是否含所需生长因素的前体物质）、通气条件、培养基pH值、培养温度等。若在这些条件下，所缺乏的生长因素得以合成，则对这些生长因素的需要就发生变化。 （1）维生素：因为只是作为酶的活性基，所以需要量一般很少，其浓度范围为1~50 μg/L，甚至更低。其功能见表3-15。 表3-15某些维生素的功能

氨基酸 含量(占总N%) 氨基酸 含量(占总N%) 丙氨酸 精氨酸 谷氨酸 亮氨酸 脯氨酸 异亮氨酸 25 8 8 6 5 3.5 苏氨酸 缬氨酸 苯丙氨酸 蛋氨酸 胱氨酸 3.5 3.5 2.0 1.0 1.0

如果微生物缺乏用于合成某种氨基酸的酶，致使不能合成这种氨基酸，那么只有供给这种氨基酸或含这种氨基酸的小分子肽，微生物才能生长。在这些情况下，培养基中一种氨基酸的存在会抑制微生物对其它氨基酸的摄取。因此必须注意使所有的氨基酸保持在适当的低水平上，或者只供给小分子肽来满足微生物对氨基酸的需要。小分子肽很容易进入细胞，随后即被肽酶水解成氨基酸。 (3)嘌呤、嘧啶及它们的衍生物：嘌呤、嘧啶的主要功能是构成核酸和辅酶。许多微生物能“从无到有”合成嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸。微生物也能够或必须从环境中吸收嘌呤、嘧啶类营养物质。嘌呤和嘧啶进入细胞后，必须先转变成核苷和核苷酸后才能被利用。形成核苷酸的途径有两条：一条是从嘌呤（或嘧啶）直接形成相应的单磷酸核苷酸；另一条是间接形成，即先形成核苷，然后再形成单磷酸核苷酸。如果微生物中只有第一条途径（只存在第一条途径的酶），那么它就只能利用游离碱基（嘌呤、嘧啶）；如果还存在第二条途径（也指酶），则游离碱基和核苷均可作为生长因子来利用。核苷酸一般不作为生长因子，从而使其难以透过细胞膜而进入细胞。 　　某些细菌的生长需要嘌呤和嘧啶，以合成核苷酸。最大生长量所需要的浓度是10μg/ml。有些微生物既不能自己合成嘌呤或嘧啶核苷酸，也不能利用外源嘌呤和嘧啶来合成核苷酸，因此必需供给核苷或核苷酸才能使其生长。这些微生物对核苷和核苷酸的需要量都较大，满足最大生长所需浓度约为200~2000μg/ml。 (4)脂肪酸等组成细胞膜的类脂成分：有些微生物（主要是枝原体、原生动物和某些细菌和放线菌）不能合成脂肪酸等组成细胞膜的（一种或数种）类脂成分。因此这些微生物只有在添加了这些特定成分的培养基中才能生长。 　　微生物对长链脂肪酸的需要比较普遍，所要求的浓度一般在1~60mg/ml之间。高浓度的长链脂肪酸对微生物有毒害作用。长链脂肪酸进入微生物细胞后，可直接或经转化后渗入到组成膜的类脂中去。 　　有些微生物生长也需要微量的固醇、胆碱和和肌醇等，它们都是组成细胞膜磷脂的成分，许多枝原体和原生动物生长需要某些固醇，酵母通常需要内消旋肌醇，某些肺炎球菌生长需要胆碱。微生物所需的胆碱和肌醇的浓度一般为10~20mg/ml。 (5)氧：许多微生物包括许多工业微生物与高等生物一样需要分子氧。由于分子氧相对不溶于水，因此需氧的微生物在液体培养基中生长时，必须不断地供给氧（空气），以使培养基中有一定量的溶解氧（dissolved oxygen，简写DO）。温度升高，或搅拌速度下降，均会使DO下降。DO还与通气时色气泡分散度、液层厚度、液面压力等有关。许多需氧微生物，包括杆菌、霉菌和放线菌，在适宜的液体培养基中静止培养，能在液体表面形成菌膜。若用震荡或通气培养，则杆菌呈单细胞状，而霉菌和放线菌的菌丝则常常交织成小球。

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三、营养物质的跨膜输送
　　营养物质进入细胞的过程不外乎是营养物质扩散进入细胞或者是细胞将营养物质吸收入细胞。营养物质能否扩散入细胞，是由质膜的物理化学性质决定的。
　　微生物细胞个体小，比表面积大，这是通过细胞表面进行物质交换的有利条件。微生物细胞表面有细胞壁和细胞膜。细胞壁能对大分子量的化合物起屏障作用。但生长中微生物的细胞壁对许多大分子来说，几乎是可以自由透过的。为了研究的方便，只把细胞质膜作为物质进出细胞的主要屏障。环境中的微生物细胞通过膜与环境发生物质交换，但由于膜上蛋白质和酶系统的存在使交换过程表现出复杂的生物学特性。营养物质进入微生物细胞的方法和速度取决于以下诸因素：
1.营养物质的性质：包括分子大小、电荷、结构及光学异构类型等。
2.细胞（即质膜）所处的环境条件：即渗透压、pH、温度、氧分压、表面活性剂等。
3.细胞的结构和功能：如种类、表现形态、菌龄、生理状态及代谢活性等。
　　在研究营养物质进入细胞的过程中，人们发现有些过程需要有能量偶合，有的则不需要（表现在前一种过程受能量生成抑制剂及氧化磷酸化解偶联剂的影响）。还发现营养物质进入细胞的过程有时会表现出饱和效应和竞争效应。若对具有这两种效应的微生物进行诱变，则可以获得一些突变株，表现为营养物质不能进入或很难进入细胞。可见这种进入过程是借助于“载体”来进行的，而且“载体”也是由DNA编码的。
根据营养物质进入细胞是否需要提供代谢能，可以把营养物质进入细胞的过程分为主动输送（active transport）和被动扩散（passive diffusion）两大类。因为主动输送需由细胞提供代谢能量，细胞起主导作用，是细胞吸收营养的过程，故也有主动吸收之称。主动输送过程均需要由载体来输送溶质分子。有些被动扩散过程也要借助于载体，故也有被动输送之称。

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⒋ 接种量
　　移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例，称为接种量。发酵罐的接种量的大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。不同的微生物其发酵的接种量是不同的，如制霉菌素发酵的接种量为0.1％～1％，肌苷酸发酵接种量1.5％～2％，霉菌的发酵接种量一般为10％，多数抗生素发酵的接种量为7％～15％，有时可加大到20％～25％。
　　接种量的大小与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度有关。有些产品的发酵以接种量大一些较为有利，采用大接种量，种子进入发酵罐后容易适应，而且种子液中含有大量的水解酶，有利于对发酵培养基的利用。大接种量还可以缩短发酵罐中菌体繁殖至高峰所需的时间，使产物合成速度加快。但是，过大的接种量往往使菌体生长过快、过稠，造成营养基质缺乏或溶解氧不足而不利于发酵；接种量过小，则会引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常等等。但是，对于某些品种，较小的接种量也可以获得较好的生产效果。例如，生产制霉菌素时用1％的接种量，其效果较用10％的为好，而0.1％接种量的生产效果与1％的生产效果相似。
　　近年来，生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施。如谷氨酸生产中，采用高生物素，大接种量，添加青霉素的工艺。为了加大接种量，有些品种的生产采用双种法，即2个种子罐的种子接入1个发酵罐。有时因为种子罐染菌或种子质量不理想，而采用倒种法，即倒出1个发酵罐部分适宜的发酵液作为另一发酵罐的种子。有时2只种子罐中有1只染菌，此时可采用混种进罐的方法，即以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子。以上三种接种方法运用得当，有可能提高发酵产量，但是其染菌机会和变异机会增多。

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　⒌ 种子质量标准
　　不同产品、不同菌种以及不同工艺条件的种子质量有所不同，况且，判断种子质量的优劣尚需要有丰富的实践经验。发酵工业生产上常用的种子质量标准，大致有如下几个方面。
　　⑴ 细胞或菌体　种子培养的目的是获得健壮和足够数量的菌体。因此，菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质量的重要指标。菌体形态可通过显微镜观察来确定，以单细胞菌体为种子的质量要求是菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。
　　菌体的生长量也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。种子液外观如颜色、黏度等也可作为种子质量的粗略指标。
　　⑵ 生化指标　种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映，不少产品的种子液质量是以这些物质的利用情况及变化为指标。
　　⑶ 产物生成量　种子液中产物的生成量是多种发酵产品发酵中考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少是种子生产能力和成熟程度的反映。
　　⑷ 酶活力　测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，是一种较新的方法。如土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系，因此种子液淀粉酶活力可作为判断该种子质量的依据。
　　此外，种子应确保无任何杂菌污染。

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⒍ 种子异常的分析
　　在生产过程中，种子质量受各种各样因素的影响，种子异常的情况时有发生，会给发酵带来很大的困难。种子异常往往表现为菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁三个方面。
　　⑴ 菌种生长发育缓慢或过快　菌种在种子罐生长发育缓慢或过快和孢子质量以及种子罐的培养条件有关。生产中，通入种子罐的无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。生产中，培养基灭菌后需取样测定其pH值，以判断培养基的灭菌质量。
　　⑵ 菌丝结团　在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状称为菌丝团。这时从培养液的外观就能看见白色的小颗粒，菌丝聚集成团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收。如果种子液中的菌丝团较少，进入发酵罐后，在良好的条件下，可以逐渐消失，不会对发酵产生显著影响。如果菌丝团较多，种子液移入发酵罐后往往形成更多的菌丝团，影响发酵的正常进行。菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关，一个菌丝团可由一个孢子生长发育而来，也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成。
　　⑶ 菌丝粘壁　菌丝粘壁是指在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上。其结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。以真菌为生产菌的种子培养过程中，发生菌丝粘壁的机会较多。

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㈡ 分子育种技术
　　分子育种是应用基因工程手段来进行的，基因工程是一种DNA体外重组技术，是在分子水平上，根据需要，用人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传性状。这种使DNA分子进行重组，再在受体细胞内无性繁殖的技术又称为分子克隆。通过基因工程改造后的菌株称为工程菌。近年来，工程菌已逐渐开始应用发酵生产中。
　　近年来，直接将基因克隆到链霉菌寄主中的质粒载体和噬菌体载体的开发取得了相当快的进展。链霉菌的基因克隆技术可用于提高抗生素产生菌的发酵单位和产生新的抗生素。

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⒈ 链霉菌的基因克隆
　　链霉菌基因克隆的基本步骤如下：
　　⑴ 制备供体DNA　对供体菌进行适当培养后，分离染色体DNA，用限制性内切酶将染色体DNA切成大小不等的DNA片段。
　　⑵ 制备载体DNA　载体是链霉菌质粒或噬菌体，往往是经过高度修饰的、能提供多种优良性状的环状DNA。它通常具备有复制起始点(提供自主复制能力)和遗传标记(常为抗生素耐药基因)。遗传标记基因有两种类型，当被克隆的供体DNA片段和载体连接时，一种遗传标记基因不会失活，便于将来筛选转化子。另一种遗传标记基因中含有限制性内切酶位点，供体DNA片段插入该位置可使该基因功能丧失。分离载体DNA(质粒)时，为了挑选含有质粒的细胞，培养基中应含有适当量的药物，分离到的载体DNA用限制性内切酶消化，使载体DNA产生与供体DNA片段末端相匹配的黏性末端。再用磷酸化酶脱磷，以防止没有插入DNA时载体重新环化。
　　⑶ 连接载体和供体DNA片段　在连接酶作用下，利用限制性内切酶所切出的黏性末端来连接载体和供体DNA。
　　⑷ 将受体菌制成原生质体　选择受体菌株应考虑受体菌表型、转化效率、限制性内切酶活性和DNA酶活性。受体菌株必须缺乏一种酶活力，当基因克隆到载体并转入受体菌时，可由该基因的产物来补充这种酶活性。例如克隆一种耐药基因，就要求受体菌株对那种药物敏感；克隆一种氨基酸生物合成有关的基因，就要求受体菌株是该种氨基酸的营养缺陷型。受体菌的转化效率受自身的转化能力、载体、已经转化的原生质体的再生能力等因素的影响。受体菌的限制性内切酶活性能限制来自供体的插入DNA，因此需设法降低该酶的活性，解决此矛盾主要有如下三种方法：① 挑选限制性内切酶活性低的菌株为受体菌；② 对受体菌诱变，降低限制性内切酶活力；③ 对原生质体进行热处理，以降低限制性内切酶活力。许多菌株具有不耐热的限制性内切酶，原生质体在45～50 ℃培养10～15 min，使其限制性内切酶变性，但原生质体存活，且能进行转化。一些链霉菌具有使DNA降解的DNA酶，它由原生质体往外渗漏，或是存在于某些原生质体溶解后的溶液中。因此，如果质粒DNA加到原生质中时，将有部分DNA降解，而使得转化效率降低。可用热处理或在加入质粒DNA之前先在原生质体中加入异源DNA(如小牛胸腺DNA)，以减少DNA酶对质粒DNA的降解。
　　受体菌的原生质体制备一般需将细胞在含有0.5％的甘氨酸的培养基中培养，使菌丝体对溶菌酶的处理更加敏感。
　　⑸ 转化作用　用PEG将DNA导入原生质体中。
　　⑹ 再生和选择　在转化之后，要有一定时间让编码耐药酶的基因进行表达，同时在细胞内形成足够量的耐药酶以显示耐药表型。因此，假如被转化的原生质体直接涂在含有药物的培养基上，它们将会被杀死。相反，当它们被涂在不含有药物的再生培养基上，与未被转化的原生质体一起进行一段时间的非选择性再生。此后，加药物到再生培养基上，那么没有被转化的原生质体被杀死，而转化体存活下来了。

平菇叶

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⒉ 链霉菌抗生素生物合成基因的克隆
典型的抗生素并非单一基因的产物，因此只有把所有与该抗生素生物合成有关的结构基因克隆到适宜的宿主中去才能得到一个理想的克隆体。如果所用的宿主对这个抗生素是敏感的，还需将抗性基因一起转入宿主。幸运的是合成某种抗生素所需的全套基因，甚至包括抗性基因往往排列成簇，这就使得分离抗生素生物合成基因比原来想象的要容易一些。在克隆抗生素生物合成基因方面前人已总结出如下七个克隆策略。
　　⑴ 检测克隆到标准宿主中的个别基因产物；
　　⑵ 利用产生菌阻断突变株的互补作用；
　　⑶ 利用突变克隆技术；
　　⑷ 连锁的抗生素抗性基因的克隆；
　　⑸ 用人工合成的寡核苷酸探测基因文库（gene library）；
　　⑹ 直接克隆抗生素产生菌DNA大片段到非产生菌中；
　　⑺ 用一种抗生素的克隆DNA去探测相关抗生素的同源基因。
　　⒊ 利用基因工程技术生产新的抗生素
　　将一种抗生素生物合成基因引入产生结构相近似的抗生素产生菌，可改造抗生素的结构。如将放线紫红素全部生物合成基因转入曼得霉素或榴霉素产生菌，得到曼得紫红素或二氢榴红霉素。外源基因的作用可分为两种情况。第一种情况是，外源基因转入后，使原来不具备羟化酶基因的曼得霉素产生菌获得了来自放线紫红素产生菌的羟化酶基因。由于放线紫红素和曼得霉素的结构相似，放线紫红素产生菌的羟化酶基因产物，可使曼得霉素羟基化。第二种情况是放线紫红素的生物合成基因产物，利用了原来存在于榴霉素产生菌中能合成放线紫红素部分结构的前体物质，与榴霉素生物合成酶共同起作用，合成了兼有二者结构的二氢榴红霉素。
　　随着基因工程育种技术的发展，目前已可能将供体菌的个别基因从一整套的生物合成基因中转移给别的链霉菌，或者将其完整的生物合成基因转移到别的链霉菌进行重组，并得到表达。这样，人们有可能运用基因工程育种技术人为地剔除某个有害的基因或引进某个需要的基因去改造已有的抗生素结构。例如，将布替罗星的侧链的生物合成基因引入卡那霉素产生菌并得到表达，就可以不经过化学方法的结构改造直接生物合成丁胺卡那霉素。

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⒋ 利用基因工程技术生产氨基酸
　　氨基酸生产菌的基因克隆系统多采用“鸟枪”法，即利用一种或几种限制性内切酶将某一菌株的DNA分子切割成相当于一个或者大于一个基因的片段，然后将这些片段一一与载体连接，制成重组DNA分子，转化到另一菌株中进行体内无性繁殖，最后对所有带有重组DNA分子的细菌（组成基因文库）进行培养和选择，从中挑出含有目的基因的转化子。
　　利用基因工程技术将氨基酸合成酶基因克隆是提高氨基酸产量的有效途径。目前，几乎所有的氨基酸合成酶基因都可以在不同系统中克隆与表达。其中苏氨酸、色氨酸、脯氨酸和组氨酸等的工程菌已达到工业化生产水平。例如在L-色氨酸生产中，利用色氨酸合成酶基因和丝氨酸转羟甲基酶(催化甘氨酸和甲醛合成丝氨酸的酶)基因的重组质粒，在大肠杆菌中克隆化。通过添加甘氨酸来制造L-色氨酸，该方法能使上述两种酶的活性提高而增产L-色氨酸。基因工程育种技术还应该和其他育种技术相结合才更为有效。例如色氨酸的工程菌经过菌种筛选，工程菌的色氨酸产量由最初的6.2 g／L上升到50 g／L。