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第三节　微生物发酵动力学

　　 发酵的生产水平高低除了取决于生产菌种本身的性能外，还要受到发酵条件、工艺等的影响。只有深入了解生产菌种在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，弄清生产菌种对环境条件的要求，掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，才能有效控制各种工艺条件和参数，以使生产菌种能始终处于生产和产物合成的优化环境之中，从而最大限度地发挥生产菌种的合成产物的能力，进而取得最大的经济效益。
生物反应动力学是研究生物反应过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律的一门科学。研究内容包括了解发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系，环境因素对三者的影响，以及影响其反应速率的条件。
根据微生物的生长和培养方式（即分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种类型），分别介绍其反应动力学。

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分批发酵动力学

　　⒈ 分批发酵的不同阶段
　　分批发酵是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。该法在发酵开始时，将微生物菌种接入已灭菌的培养基中，在微生物最适宜的培养条件下进行培养，在整个培养过程中，除氧气的供给、发酵尾气的排出、消泡剂的添加和控制pH值需加入酸或碱外，整个培养系统与外界没有其他物质的交换。分批培养过程中随着培养基中的营养物质的不断减少，微生物生长的环境条件也随之不断变化，因此，微生物分批发酵是一种非稳态的培养方法。
　　在分批发酵过程中，随着微生物生长和繁殖，细胞量、底物、代谢产物的浓度等均不断发生变化。微生物的生长可分为停滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段，图6-3为典型的细菌生长曲线。表6-4为细菌细胞在分批发酵过程中各个生长阶段的细胞特征。

图6-3　分批发酵过程中典型的细菌生长曲线

表6-4　细菌在分批发酵过程中的各个生长阶段的细胞特征

处于不同生长阶段的细胞成分也有很大的差异。图6-4为不同生长阶段细胞成分的变化曲线。

图6-4　不同生长阶段细胞成分的变化曲线

　　⑴ 停滞期　停滞期是微生物细胞适应新环境的过程。此时，微生物细胞从一个培养基被转移至另外一个培养基中，细胞需要有一个适应过程，在该过程中，系统的微生物细胞数量并没有增加，处于一个相对的停止生长的状态。但细胞内却在诱导产生新的营养物质运输系统，可能有一些基本的辅助因子会扩散到细胞外，同时参与初级代谢的酶类再调节状态以适应新的环境。
　　实际上，接种物的生理状态和浓度是停滞期长短的关键。如果接种物处于对数期，那么就很有可能不存在停滞期，微生物细胞立即开始生长。反过来，如果接种物本身已经停止生长，那么微生物细胞就需要有更长的停滞期，以适应新的环境。
　　⑵ 对数期　处于对数期的微生物细胞的生长速率大大加快，单位时间内细胞的数目或质量的增加维持恒定，并达到最大值。如在半对数纸上用细胞数目或质量的对数值对培养时间作图，将可得到一条直线，该直线的斜率就等于μ。

如果当t=0时，细胞的浓度为c0(X)，上式积分后就为：

　　微生物的生长有时也可用“倍增时间”（td）表示，定义为微生物细胞浓度增加一倍所需要的时间，即

　　微生物细胞比生长速率和倍增时间因受遗传特性及生长条件的控制，有很大的差异。表6-5列出了几种不同的微生物受培养基和碳源综合影响时的比生长速率和倍增时间。应该指出的是，并不是所有微生物的生长速度都符合上述方程。如当用碳氢化合物作为微生物的营养物质时，营养物质从油滴表面扩散的速度会引起对生长的限制，使生长速率不符合对数规律。某些丝状微生物的生长方式是顶端生长，营养物质在细胞内的扩散限制也使其生长曲线偏离上述规律。
表6-5　微生物的比生长速率和倍增时间

微 生 物	碳　　源	比生长速率/h-	倍增时间/min
大肠杆菌   中型假丝酵母   地衣芽孢杆菌	复合物 葡萄糖+无机盐 醋酸+无机盐 琥珀酸+无机盐 葡萄糖+维生素+无机盐 葡萄糖+无机盐 C6H14+维生素+无机盐 葡萄糖+水解酪蛋白 葡萄糖+无机盐 谷氨酸+无机盐	1.2 2.82 3.52 0.14 0.35 1.23 0.13 1.2 0.69 0.35	35 15 12 300 120 34 320 35 60 120

　　⑶ 稳定期　在微生物的培养过程中，随着培养基中的营养物质的消耗和代谢产物的积累或释放，微生物的生长速率也就随之下降，直至停止生长。当所有微生物细胞分裂或细胞增加的速率与死亡的速率相当时，微生物的数量就达到平衡，微生物的生长也就进入了稳定期。在微生物生长的稳定期，细胞的质量基本维持稳定，但活细胞的数量可能下降。
由于细胞的自溶作用，一些新的营养物质，诸如细胞内的一些糖类、蛋白质等被释放出来，又作为细胞的营养物质，从而使存活的细胞继续缓慢地生长，出现通常所称的二次或隐性生长。
　　⑷ 衰亡期　当发酵过程处于衰亡期时，微生物细胞内所储存的能量已经基本耗尽，细胞开始在自身所含的酶的作用下自溶死亡。
需要注意的是，微生物细胞生长的停滞期、对数期、稳定期和衰亡期的时间长短取决于微生物的种类和所用的培养基。

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⒉ 微生物分批发酵的生长动力学方程
　　分批发酵过程中，虽然培养基中的营养物质随时间的变化而变化，但通常在特定条件下，其比生长速率往往是恒定的。1942年，Monod提出了在特定温度、pH值、营养物类型、营养物浓度等条件下，微生物细胞的比生长速率与限制性营养物的浓度之间存在如下的关系式（Monod方程）：

式中　μm——微生物的最大比生长速率，h-1；
c(S)——限制性营养物质（底物）的浓度，g／L；
Ks——饱和常数，g／L。
　　Ks的物理意义为当比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性营养物质浓度，它的大小表示了微生物对营养物质的吸收亲和力大小。Ks越大，表示微生物对营养物质的吸收亲和力越小；反之就越大。对于许多微生物来说，Ks值是很小的，一般为0.1～120 mg／L或0.01～3.0 mmol／L，这表示微生物对营养物质有较高的吸收亲和力。一些微生物的Ks值见表6-6。
表6-6　一些微生物的Ks值

　　微生物生长的最大比生长速率μm在工业生产上有很大的意义，μm随微生物的种类和培养条件的不同而不同，通常为0.09～0.65 h-1。一般来说，细菌的μm大于真菌。而就同一细菌而言，培养温度升高，μm增大；营养物质的改变，μm也要发生变化。通常容易被微生物利用的营养物质，其μm较大；随着营养物质碳链的逐渐加长，μm则逐渐变小。

图6-5　微生物比生长速率与底物浓度之间的关系
　　微生物比生长速率μ与底物浓度c(S)之间有一定的关系，如图6-5所示。图中线段a表示营养物质浓度很低，即c(S)<<Ks时，微生物的比生长速率与营养物质浓度的关系为线性关系，此时Monod方程可写为；线段b为适合Monod方程段；线段c表示营养物质浓度很高，即c(S)>>Ks时，微生物的比生长速率与营养物质浓度的关系。正常情况下，μ≈μm，但这也正是由于营养物质或代谢产物导致抑制作用的区域，目前尚没有相应的理论方程描述此区域的情况，但有时可按下式表达：

式中　KI——抑制常数。
　　因此，实践上为了避免发生营养物质的抑制作用，分批发酵不应在高营养物质浓度下开始进行。
　　除Monod方程外，还有其他一些类似的微生物生长动力学方程式，但在大多数情况下，实验数据与Monod方程较为接近，因此Monod方程的应用也更为广泛。

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补料分批发酵

　　补料分批发酵是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法，又称半连续培养或半连续发酵，是介于分批培养过程与连续培养过程之间的一种过渡培养方式。目前，补料分批发酵已在发酵工业上普遍被用于氨基酸、抗生素、维生素、酶制剂、单细胞蛋白、有机酸以及有机溶剂等的生产过程。
　　⒈ 补料分批发酵的类型
　　由于目前补料分批发酵的类型很多，分类比较混乱，尚未有统一的分类方法。就补料的方式而言，有连续补料、不连续补料和多周期补料；每次补料又可分为快速补料、恒速补料、指数速度补料和变速补料；按生物反应器中发酵体积区分，又有变体积和恒体积之分；从生物反应器数目分类又有单级和多级之分；从补加的培养基成分来区分，又可分为单一组分补料和多组分补料。图6-6为微生物补料分批发酵类型及其操作过程。

图6-6　微生物补料分批发酵类型及其操作过程
F—流速；V—发酵液体积；c(S)—限制性营养物质浓度
①—指数速率补料培养；②—恒速补料培养；③—变速补料培养
　　发酵过程中不同的补料方法对细胞密度、生长速率及生产率均有影响，情况如表6-7所示。
表6-7　补料方法对细胞密度、生长速率及生产率的影响

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⒉ 补料分批发酵的动力学
　　⑴ 单一补料分批发酵　单一补料分批发酵是补料分批发酵中的一种类型，其特点是补料一直到培养液达到额定值为止，培养过程中不取出培养液。
　　⑵ 重复补料分批发酵　重复补料分批发酵是在培养过程中，每间隔一定的时间，取出一定体积的培养液，同时又在同一时间间隔内加入相等体积的培养基，如此反复进行的培养方式。采用这种培养方式，培养液体积、稀释率、比生长速率以及其他与代谢有关的参数都将发生周期性的变化。表6-8为连续流加和分批流加发酵的比较。
表6-8　连续流加和分批流加发酵的比较

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⒊ 补料分批发酵的优点
　　补料分批发酵是介于分批发酵和连续发酵之间的一种微生物细胞的培养方式，它兼有两种培养方式的优点，并在某种程度上克服了它们所存在的缺点。表6-9为补料分批发酵的一些优点。
表6-9　补料分批发酵的一些优点

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第四节　微生物生长代谢过程中的质量平衡 微生物生长过程中的碳源平衡

　　⒈ 碳源平衡
　　以糖为碳源的微生物生长代谢过程中，碳源主要用于：① 满足菌体生长的消耗，可用[Δc(S)]G表示；② 维持菌体生存的消耗(如微生物的运动、物质的传递，其中包括营养物质的摄取和代谢产物的排泄)，用[Δc(S)]m表示；③ 代谢产物积累的消耗，用[Δc(S)]P表示；④ 其余的消耗，可忽略不计。

设　YG表示用于生长的碳源对菌体的得率常数，则有

设　m表示微生物的碳源维持常数，则有

设　Ym表示碳源对代谢产物的得率常数，则有

由此得底物消耗动力学模型：

　　在以生产细胞物质为目的的发酵过程中(如面包酵母生产和单细胞蛋白生产及污水处理等)，代谢产物的积累可以忽略不计的情况下，上式可简化为：

　　该式是一直线方程，通过用实验求得微生物生长比速率μ和对应的基质消耗比速率v的关系进行作图，可得到一直线。如图6-7所示，直线在纵坐标上的截距即为碳源维持常数m，其斜率即为碳源对菌体生长得率常数YG的倒数。

图6-7　μ对v作图
　　⒉ 细胞物质生产过程中碳源的化学平衡
　　面包酵母与单细胞蛋白工业是典型的细胞物质生产。用葡萄糖为碳源通风培养面包酵母时可建立下列化学平衡：

　　如果计入酵母菌体内除碳、氢、氧三元素以外的其他元素如磷、氮以及其他灰分，则每200 g葡萄糖约可得到100 g干酵母，这就是说在酵母生产中若葡萄糖浓度控制适当，通风供给充足的溶解氧的情况下，葡萄糖消耗对酵母的得率系数Yx／s＝0.5。实际上在不同情况下，Yx／s有很大的不同。当限制性基质浓度较高时，微生物的生长比速率较大，而基质的维持消耗相对要小得多，即，于是

　　⒊ 碳源平衡的意义
　　① 碳源是微生物生长和代谢过程必不可少和最重要的物质，无论哪一种发酵，碳源的利用情况或碳源对产物的转化率都是一项极为重要的经济指标。碳平衡可以使我们了解到碳源在微生物生长和代谢过程中的动向，使我们通过实验和理论计算得到碳源对产物的最大得率，为生产水平不断提高提供可靠的依据。
　　② 对于一般发酵过程，我们可以用菌体的生长速率、产物的积累速率和基质的消耗速率三个模型进行描述。基质消耗的数学模型就是以碳平衡得到的方程式为依据的。

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发酵工艺最优化控制

　　在特定的发酵生产过程中，生产效率的高低取决于工艺和工艺控制的最优化。生产过程最优化控制的实现，包含了从明确目标到目标值实施等全部内容。
　　⒈ 明确控制目标
　　一个工业过程的目标有产量、质量、单一指标或综合指标等。通常在发酵过程中，微生物的新陈代谢活动是发酵液的物性和组成随时间的变化不断发生变化的过程。对这种不稳定的动态过程进行最优化控制，所需明确的目标必然是以一定时间内积分的形式出现的值。由于发酵生产过程的主要目的是获得最大量、最佳质量的发酵产物，最优化控制的目标应是得到最大产物比生成速率，其次才是最短的生产周期，并由此获得最佳的经济效益。
　　⒉ 明确影响因素
　　为了最优化控制发酵过程，必须充分地了解影响目标值的各种因素，并通过动力学关系获得发酵过程的各项最佳参数。影响产物比生成速率的因素主要有营养物质的浓度、种类、比例、溶解氧浓度以及氧化还原电位、CO2、发酵液黏度、温度、pH值、泡沫、促进剂、前体、酶、代谢产物等理化因素，此外，还有菌体浓度、生长速率、死亡速率、细胞状态等生物因素。
　　⒊ 确定实现目标值的方法
　　由于发酵产物不易瞬时测定，因此产物比生成速率不易算出，同样由于菌体浓度测定比较复杂并有一定的局限性，即使产物的生成量可由菌体数量来体现，从菌浓方面确定目标值还是存在相当的困难。
　　实际生产过程中，基于产物的生成与营养物质的消耗之间有着平行的关系，因此可用营养物质（主要是碳源）转化成产物的得率或效率、转化率作为目标值。通过大量的试验，比较不同浓度下某一营养物质的最大转化率，再从这些数值中找出最大值，那么与此最大值相对应的浓度便是该营养物质的最佳浓度，即应该控制的该营养物质的最佳浓度。为了计算转化率，必须测定各种营养物质的消耗量和产物的生成量，工作量非常大。由于葡萄糖通常是最主要和数量最多的限制性营养物质，为了减少测定工作量，可以先测定葡萄糖的消耗量，获得最佳的葡萄糖浓度参数，之后便可按原培养基的配比，试验各种营养物质与葡萄糖的最佳比例，由此得到最佳的营养物质参数。
　　由于发酵过程可以分为以生长为主的生长阶段和以产物生成为主的生产阶段，因此目标值还应包括最大比生长速率。在生长阶段需提供获得最大比生长速率的条件，而在生产阶段，菌体衰老前需提供最大转化率条件，分别确定和控制各阶段的最佳参数。
　　⒋ 确定最佳工艺
　　由实验得到的最佳营养条件和环境条件，需要变成工艺控制条件，才能对发酵过程进行最优化控制。例如：营养物质的种类、浓度和比例需转化成培养基原料的种类、浓度和比例；溶解氧浓度需转化为发酵罐搅拌转速和通气量；前体物质、促进剂添加和流加补料的方式和时间需根据各项参数来确定最佳的生产工艺。
　　⒌ 实施最佳工艺
　　实施最佳工艺就是通过优化管理，严格执行发酵工艺，将发酵控制在最佳状态，从而最终实现目标值，达到最大的产物比生成速率。要实现最佳工艺必须对诸如温度、pH值、溶解氧浓度、泡沫等进行控制。

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第七章发酵工艺过程控制

发酵产品生产过程是非常复杂的生物化学反应过程。为了使生产过程达到预期的目的，获得较高的产品得率，只有采取各种不同方法测定生物代谢过程中代谢变化的各种参数，掌握代谢过程的变化情况，结合代谢控制理论，才能有效控制发酵过程。 　 不管是微生物发酵还是动植物细胞的培养过程，均是细胞按照生命固有的一系列遗传信息，在所处的营养和培养条件下，进行复杂而细微的各种动态的生化反应的集合。为了充分表达生物细胞的生产能力，对某一特定的生物来讲，就要研究细胞的生长发育和代谢等生物过程，以及各种生物、理化和工程环境因素对这些过程的影响。因此研究菌体的培养规律、外界控制因素对过程影响及如何优化条件，达到最佳效果是发酵工程的重要任务。本章主要介绍微生物发酵的工艺过程控制。

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第一节发酵过程中的代谢变化与控制参数
　　前已述及微生物发酵有三种方式即分批发酵(batchfermentation)、补料分批发酵(fed-batchfermentation)和连续发酵(continuousfermentation)。工业上为了防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大都采用分批发酵或补料分批发酵这两种方式。其中补料分批发酵已被广泛采用，因为它的技术介于分批发酵和连续发酵之间，兼有两者的优点，又克服了它们的缺点。各种不同发酵方式菌体代谢变化也不相同，但为了了解其基本变化，仍以分批发酵为基础来说明其代谢规律。
　 微生物的分批发酵过程，因其代谢产物的种类不同而有一定的差异，但大体上是相同的。产生菌体经过一定时间不同级数的种子培养，达到一定菌体量后，移种到发酵罐进行纯种和通气搅拌发酵（发酵工业中，绝大部分是好氧发酵），到规定时间即结束。
如在霉菌、放线菌的发酵过程中，随着菌体的生长和繁殖，培养液的物理性质、菌体形态和生理状态都可能会发生显著的变化，如：培养液的表观黏度可能增大，液体的流变学特性改变，进而影响罐内的氧传递、热传递和液体混合等过程。细胞在初期和后期的生理活性也不相同。因此，了解各种不同菌体在发酵过程中的生长曲线及代谢变化，有利于对发酵过程进行控制。
　 从产物形成来说，代谢变化就是反映发酵中的菌体生长、发酵参数的变化(培养基和培养条件)和产物生成速率这三者之间的关系。按照菌体生长、碳源的利用、产物的生成速率的变化以及这三者之间的动力学关系来考虑，Gaden把微生物发酵过程分为三种类型(参见第五章)。微生物的代谢产物，按其与菌体生长、繁殖的关系来说，又分为初级代谢产物(primarymetabolite)和次级代谢产物(secondarymetabolite)。对微生物酶、药物来说，这两类产物都有，特别是抗生素这类次级代谢产物在微生物药物中占有最大的比重。