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第四节溶解氧对发酵的影响及其控制
一、溶解氧对发酵的影响
　　在发酵过程中，影响耗氧的因素有以下几方面：
　　⑴培养基的成分和菌浓显著影响耗氧培养液营养丰富，菌体生长快，耗氧量大；菌浓高，耗氧量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取量随之增大。
　　⑵菌龄影响耗氧呼吸旺盛时，耗氧量大。发酵后期菌体处于衰老状态，耗氧量自然减弱。
　　⑶发酵条件影响耗氧在最适条件下发酵，耗氧量大。
　　发酵过程中，排除有毒代谢产物如二氧化碳、挥发性的有机酸和过量的氨，也有利于提高菌体的摄氧量。
　　在25℃，0.10MPa下，空气中的氧在水中的溶解度为0.25mmol／L，在发酵液中的溶解度只有0.22mmol／L，而发酵液中的大量微生物耗氧迅速(耗氧速率大于25～100mmol／L·h)。因此，供氧对于好氧微生物来说是非常重要的。在好氧发酵中，微生物对氧有一个最低要求，满足微生物呼吸的最低氧浓度叫临界溶氧浓度(criticalvalueofdissolvedoxygenconcentration)，用c临界表示。在c临界以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降。一般好氧微生物c临界很低，约为0.003～0.05mmol／L，需氧量一般为25～100mmol／(L·h)。其c临界大约是氧饱和溶解度的1％～25％。
　　当不存在其他限制性基质时，溶氧高于c临界，细胞的比耗氧速率保持恒定；如果溶氧低于c临界，细胞的比耗氧速率就会大大下降，细胞处于半厌氧状态，代谢活动受到阻碍。培养液中维持微生物呼吸和代谢所需的氧保持供氧与耗氧的平衡，才能满足微生物对氧的利用。液体中的微生物只能利用溶解氧，气液界面处的微生物还能利用气相中的氧，故强化气液界面也将有利于供氧。
　　溶氧是好氧发酵控制最重要的参数之一。由于氧在水中的溶解度很小，在发酵液中的溶解度更小，因此，需要不断调整通风和搅拌，才能满足不同发酵过程对氧的需求。溶氧的大小对菌体生长和产物的形成及产量都会产生不同的影响。如谷氨酸发酵，供氧不足时，谷氨酸积累就会明显降低，产生大量乳酸和琥珀酸。又如薛氏丙酸菌发酵生产维生素B12中，维生素B12的组成部分咕啉醇酰胺(cobinamide，又称B因子)的生物合成前期的两种主要酶就受到氧的阻遏，限制氧的供给，才能积累大量的B因子，B因子又在供氧的条件下才转变成维生素B12，因而采用厌氧和供氧相结合的方法，有利于维生素B12的合成。在天冬酰胺酶的发酵中，前期是好氧培养，而后期转为厌氧培养，酶的活力就能大为提高。掌握好转变时机颇为重要。据实验研究，当溶氧下降到45％时，就从好氧培养转为厌氧培养，酶的活力可提高6倍，这就说明利用控制溶氧来控制发酵的重要性。对抗生素发酵来说，氧的供给就更为重要。如金霉素发酵，在生长期短时间停止通风，就可能影响菌体在生产期的糖代谢途径，由HMP途径转向EMP途径，使金霉素产量减少。金霉素C6上的氧还直接来源于溶氧，所以，溶氧对菌体代谢和产物合成都有影响。
　　综上所述，好氧发酵并不是溶氧愈大愈好。溶氧高虽然有利于菌体生长和产物合成，但溶氧太大有时反而抑制产物的形成。因为，为避免发酵处于限氧条件下，需要考查每一种发酵产物的c临界和最适溶氧浓度(optimaloxygenconcentration)，并使发酵过程保持在最适溶氧浓度。最适溶氧浓度的大小与菌体和产物合成代谢的特性有关，这是由实验来确定的。据报道，次级代谢的青霉素发酵的c临界为5％～10％之间，低于此值就会给青霉素合成带来损失，时间愈长，损失愈大。而初级代谢的氨基酸发酵，需氧量的大小与氨基酸的合成途径密切相关。根据发酵需氧要求不同可分为三类(见图7-4)：第一类有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸，它们在菌体呼吸充足的条件下，产量才最大，如果供氧不足，氨基酸合成就会受到强烈的抑制，大量积累乳酸和琥珀酸；第二类，包括异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，即天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得最高产量，但供氧受限，产量受影响并不明显；第三类，有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，仅在供氧受限、细胞呼吸受抑制时，才能获得最大量的氨基酸，如果供氧充足，产物形成反而受到抑制。

图7-4氨基酸的相对产量与氧的满足程度之间的相关性

　　氨基酸合成的需氧程度产生上述差别的原因，是由它们的生物合成途径不同所引起的，不同的代谢途径产生不同数量的NAD(P)H，当然再氧化所需要的溶氧量也不同。第一类氨基酸是经过乙醛酸循环和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统两个途径形成的，产生的NADH量最多。因此NADH氧化再生的需氧量为最多，供氧愈多，合成氨基酸当然亦愈顺利。第二类的合成途径是产生NADH的乙醛酸循环或消耗NADH的磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统，产生的NADH量不多，因而与供氧量关系不明显。第三类，如苯丙氨酸的合成，并不经过TCA循环，NADH产量很少，过量供氧，反而起到抑制作用。肌苷发酵也有类似的结果。由此可知，供氧大小是与产物的生物合成途径有关。
　　在抗生素发酵过程中，菌体的生长阶段和产物的生成阶段都有一个临界溶氧浓度，分别为c’临界和c’’临界。两者的关系有：①c’临界≈c’’临界；②c’临界>c’’临界③c’临界<c’’临界。
　　目前，发酵工业中，氧的利用率(oxygenutilizationrate)还很低，只有40％～60％，抗生素发酵工业更低，只有2％～8％。好氧微生物的生长和代谢活动都需要消耗氧气，它们只有在氧分子存在的情况下才能完成生物氧化作用。因此，供氧对于好氧微生物是必不可少的。

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二、供氧与微生物呼吸代谢的关系
　　好氧微生物生长和代谢均需要氧气，因此供氧必须满足微生物在不同阶段的需要。由于各种好氧微生物所含的氧化酶系(如过氧化氢酶、细胞色素氧化酶、黄素脱氢酶、多酚氧化酶等)的种类和数量不同，在不同的环境条件下，各种不同的微生物的吸氧量或呼吸强度是不同的。
　　微生物的吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方法来表示。呼吸强度又称氧比消耗速率，是指单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以表示，单位为mmolO2／(g干菌体·h)。　　耗氧速率又称摄氧率，是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，以r表示，单位为mmolO2／(L·h)。呼吸强度可以表示微生物的相对吸氧量，但是，当培养液中有固体成分存在时，测定起来有困难，这时可用耗氧速率来表示。微生物在发酵过程中的耗氧速率取决于微生物的呼吸强度和单位体积菌体浓度。

式中r——微生物的耗氧速率，mmolO2／(L·h)；
——菌体的呼吸强度，mmolO2／(g干菌体·h)；
c(X)——发酵液中菌体的浓度，g干菌体／L。
　　在发酵生产中，供氧的多少应根据不同的菌种、发酵条件和发酵阶段等具体情况决定。例如谷氨酸发酵在菌体生长期，希望糖的消耗最大限度地用于合成菌体，而在谷氨酸生产期，则希望糖的消耗最大限度地用于合成谷氨酸。因此，在菌体生长期，供氧必须满足菌体呼吸的需氧量，若菌体的需氧量得不到满足，则菌体呼吸受到抑制，从而抑制菌体生长，引起乳酸等副产物的积累，菌体收率降低。但是供氧并非越大越好，当供氧满足菌体需要，菌体的生长速率达最大值，如果再提高供氧，不但不能促进菌体生长，造成能源浪费，而且高氧水平会抑制菌体生长，且高氧水平下生长的菌体不能有效地产生谷氨酸。
　　与菌体的生长期相比，谷氨酸生产期需要大量的氧。谷氨酸的发酵在细胞最大呼吸强度时，谷氨酸产量最大。因此，在谷氨酸生产期要求充分供氧，以满足细胞最大呼吸强度的需氧量。在条件适当时，谷氨酸生产菌将60％以上的糖转化为谷氨酸。

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三、发酵过程溶氧的变化
　　在发酵过程中，在已有设备和正常发酵条件下，每种产物发酵的溶氧变化都有自己的规律。如图7-5和图7-6，在谷氨酸和红霉素发酵的前期，产生菌大量繁殖，需氧量不断增加。此时的需氧量超过供氧量，使溶氧明显下降，出现一个低峰，产生菌的摄氧率同时出现一个高峰。发酵液中的菌浓也不断上升，对谷氨酸发酵来说，菌体仍在生长繁殖，抗生素发酵的菌浓也出现一个高峰。黏度一般在这个时期也会出现一高峰阶段。这都说明产生菌正处在对数期。过了生长阶段，需氧量有所减少，溶氧经过一段时间的平稳阶段(如谷氨酸发酵)或随之上升(如抗生素发酵)后，就开始形成产物，溶氧也不断上升。谷氨酸发酵的溶氧低峰约在6～20h，而抗生素的都在10～70h，低峰出现的时间和低峰溶氧随菌种、工艺条件和设备供氧能力不同而异。

图7-5谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线


图7-6红霉素发酵过程中溶氧和黏度的曲线
　　发酵中后期，对于分批发酵来说，溶氧变化比较小。进入稳定期，因为菌体己繁殖到一定浓度，呼吸强度变化也不大，如不补加基质，发酵液的摄氧率变化也不大，供氧能力仍保持不变，溶氧变化也不大。但当外界进行补料(包括碳源、前体、消泡剂)，则溶氧就会发生改变，变化的大小和持续时间的长短，则随补料时的菌龄、补入物质的种类和剂量不同而不同。如补加糖后，发酵液的摄氧率就会增加，引起溶氧下降，经过一段时间后又逐步回升；如继续补糖，甚至降至c临界以下，而成为生产的限制因素。在生产后期，由于菌体衰老，呼吸强度减弱，溶氧也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧更会明显上升。
　　在发酵过程中，有时出现溶氧明显降低或明显升高的异常变化，常见的是溶氧下降。造成异常变化的原因有两方面：耗氧或供氧出现了异常因素或发生了障碍。据已有资料报道，引起溶氧异常下降，可能有下列几种原因：①污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在较短时间内下降到零附近，如果杂菌本身耗氧能力不强，溶氧变化就可能不明显；②菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降；③某些设备或工艺控制发生故障或变化，也可能引起溶氧下降，如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢，影响供氧能力，使溶氧降低。又如消泡剂因自动加油器失灵或人为加量太多，也会引起溶氧迅速下降。其他影响供氧的工艺操作，如停止搅拌、闷罐(罐排气阀封闭)等，都会使溶氧发生异常变化。
　　引起溶氧异常升高的原因，在供氧条件没有发生变化的情况下，主要是耗氧出现改变，如菌体代谢出现异常，耗氧能力下降，使溶氧上升。特别是污染烈性噬菌体，影响最为明显，产生菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶氧有可能上升，直到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧就直线上升。
　　由上可知，从发酵液中的溶氧变化，就可以了解微生物生长代谢是否正常，工艺控制是否合理，设备供氧能力是否充足等问题，帮助我们查找发酵不正常的原因和控制好发酵生产。

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四、溶氧浓度控制
　　㈠氧的传递方程式
　　液相体积氧传递系数KLα代表氧由气相至液相传递的难易程度，它与发酵过程控制、放大和反应器设计密切相关。当发酵液中溶氧浓度保持稳定，即发酵过程中的氧传递量与氧消耗量达到平衡时，KLα可由下式确定：

式中OTR——氧由气相向液相的传递速率(传氧速率，oxygentakerate)，mmolO2／(L·h)；
KLα——液相体积氧传递系数，1／h；
c*——液相饱和溶氧浓度，mmolO2／L；
cL——液相实际溶氧浓度，mmolO2／L；
OUR——菌的耗氧速率(摄氧速率，oxygenuptakerate)，mmolO2／(L·h)。
　　当微生物的耗氧速率r不变，同时液相饱和溶氧浓度c*不变，KLα愈大，液相实际溶氧浓度cL愈高，故可用KLα的变化来衡量发酵罐的通气效率。
　　㈡溶氧浓度控制
　　发酵液的溶氧浓度，是由供氧和需氧两方面所决定的。也就是说，当发酵的供氧量大于需氧量，溶氧就上升，直到饱和；反之就下降。因此要控制好发酵液中的溶氧，需从这两方面着手。
　　在供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数KLɑ值。结合生产实际，在可能的条件下，采取适当的措施来提高溶氧，如调节搅拌转速或通气速率来控制供氧。但供氧量的大小还必须与需氧量相协调，也就是说，要有适当的工艺条件来控制需氧量，使产生菌的生长和产物生成对氧的需求量不超过设备的需求量不超过设备的供氧能力，使产生菌发挥出最大的生产能力。这对生产实际具有重要的意义。
　　发酵液的需氧量，受菌浓、基质的种类和浓度以及培养条件等因素的影响，其中以菌浓的影响最为明显。发酵液的摄氧速率OUR是随菌浓增加而按比例增加，但传氧速率OTR是随菌浓的对数关系减少，因此可以控制菌的比生长速率比临界比生长速率（菌株维持具有较高产物合成酶活性的“壮年”细胞占优势都必须满足一个最低比生长速率，低于它，老龄细胞将逐渐占优势，致使产物合成能力下降。这一最低比生长速率就叫临界比生长速率，以μ临表示）略高一点的水平，达到最适菌浓[即c(X)临]，菌体的生产率最高。这是控制最适溶氧浓度的重要方法。最适菌浓既能保证产物的比生产速率维持在最大值，又不会使需氧大于供氧。控制最适的菌浓可以通过控制基质的浓度来实现。如青霉素发酵，就是通过控制补加葡萄糖的速率达到最适菌浓。现已利用敏感型的溶氧电极传感器来控制青霉素发酵，利用溶氧的变化来自动控制补糖速率，间接控制供氧速率和pH值，实现菌体生长、溶氧和pH值三位一体的控制体系。
　　除控制补料速度外，在工业上，还可采用调节温度(降低培养温度可提高溶氧浓度)、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂等工艺措施，来改善溶氧水平。

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第五节菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制

一、菌体浓度对发酵的影响及控制

　　菌体（细胞）浓度(cellconcentration)是指单位体积培养液中菌体的含量。无论在科学研究上，还是在工业发酵控制上，它都是一个重要的参数。菌浓的大小，在一定条件下，不仅反映菌体细胞的多少，而且反映菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段。在发酵动力学研究中，需要利用菌浓参数来算出菌体的比生长速率和产物的比生成速率等有关动力学参数，以研究它们之间的相互关系，探明其动力学规律，所以菌浓仍是一个基本参数。
　　菌浓的大小与菌体生长速率有密切关系。比生长速率μ大的菌体，菌浓增长也迅速，反之就缓慢。而菌体的生长速率与微生物的种类和自身的遗传特性有关，不同种类的微生物的生长速率是不一样的。它的大小取决于细胞结构的复杂性和生长机制，细胞结构越复杂，分裂所需的时间就越长。典型的细菌、酵母、霉菌和原生动物的倍增时间分别为45min、90min、3h和6h左右，这说明各类微生物增殖速率的差异。菌体的增长还与营养物质和环境条件有密切关系。营养物质包括各种碳源和氮源等成分和它们的浓度。按照Monod方程式来看，生长速率取决于基质的浓度(各种碳源的基质饱和系数Ks在1～10mg／L之间)，当基质浓度c(S)>10Ks时，比生长速率就接近最大值。所以营养物质均存在一个上限浓度，在此限度以内，菌体比生长速率则随基质浓度增加而增加，但超过此上限，基质浓度继续增加，反而会引起生长速率下降。这种效应通常称为基质抑制作用。这可能是由于高浓度基质形成高渗透压，引起细胞脱水而抑制生长。这种作用还包括某些化合物(如甲醇、苯酚等)对一些关键酶的抑制，或使细胞结构成分发生变化。一些营养物质的上限浓度(g／L)如下：葡萄糖100、NH4+5、PO43-10。在实际生产中，常用丰富培养基，促使菌体迅速繁殖，菌浓增大，引起溶氧下降。所以，在微生物发酵的研究和控制中，营养条件(含溶氧)的控制至关重要。影响菌体生长的环境条件有温度、pH值、渗透压和水分活度等因素。
　　菌浓的大小，对发酵产物的得率有着重要的影响。在适当的比生长速率下，发酵产物的产率与菌浓成正比关系，即
P=QPmc(X)
式中P——发酵产物的产率(产物最大生成速率或生产率)，g／(L·h)；
QPm——产物最大比生成速率，h-1；
c(X)——菌体浓度，g／L。
　　菌浓愈大，产物的产量也愈大，如氨基酸、维生素这类初级代谢产物的发酵就是如此。而对抗生素这类次级代谢产物来说，控制菌体的比生长速率μ比μ临略高一点的水平，达到最适菌浓[即c(X)临]，菌体的生产率最高。但是菌浓过高，则会产生其他的影响，营养物质消耗过快，培养液的营养成分发生明显的改变，有毒物质的积累，就可能改变菌体的代谢途径，特别是对培养液中的溶氧，影响尤为明显。菌浓增加而引起的溶氧下降，会对发酵产生各种影响。早期酵母发酵，会出现代谢途径改变、酵母生长停滞、产生乙醇的现象；抗生素发酵中，也受溶氧限制，使产量降低。如图7-7，为了获得最高的生产率，需要采用摄氧速率OUR与传氧速率OTR相平衡时的菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化的曲线的交点所对应的菌体浓度，即临界菌体浓度c(X)临。菌体超过此浓度，抗生素的比生成速率和体积产率都会迅速下降。

图7-7摄氧速率OUR曲线与传氧速率OTR曲线关系示意图
　　发酵过程中除要有合适的菌浓外，还需要设法控制菌浓在合适的范围内。菌体的生长速率，在一定的培养条件下，主要受营养基质浓度的影响，所以要依靠调节培养基的浓度来控制菌浓。首先要确定基础培养基配方中有适当的配比，避免产生过浓(或过稀)的菌体量。然后通过中间补料来控制，如当菌体生长缓慢、菌浓太稀时，则可补加一部分磷酸盐，促进生长，提高菌浓；但补加过多，则会使菌体过分生长，超过c(X)临，对产物合成产生抑制作用。在生产上，还可利用菌体代谢产生的CO2量来控制生产过程的补糖量，以控制菌体的生长和浓度。总之，可根据不同的菌种和产品，采用不同的方法来达到最适的菌浓。

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1. 基质对发酵影响及其控制

　　基质即培养微生物的营养物质。对于发酵控制来说，基质是生产菌代谢的物质基础，既涉及菌体的生长繁殖，又涉及代谢产物的形成。因此基质的种类和浓度与发酵代谢有着密切的关系。所以选择适当的基质和控制适当的浓度，是提高代谢产物产量的重要方法。
　　据Monod方程，在分批发酵中菌体比生长速度是基质浓度的函数。在c(S)<<Ks的情况下，菌体比生长速率与基质浓度呈线性关系。在正常的情况下，可达到菌体最大比生长速率，然而，由于代谢产物及其基质过浓，而导致抑制作用，出现菌体比生长速率下降的趋势。当葡萄糖浓度低于100～150g／L，不出现抑制作用；当葡萄糖浓度高于350～500g／L，多数微生物不能生长，细胞出现脱水现象。
　　就产物的形成来说，培养基过于丰富，有时会使菌体生长过旺，黏度增大，传质差，菌体不得不花费较多的能量来维持其生存环境，即用于非生产的能量大量增加。所以，在分批发酵中，控制合适的基质浓度不但对菌体的生长有利，对产物的形成也有益处。这里要着重说明碳源、氮源和无机盐等对发酵的影响及其控制。
　　⒈碳源对发酵的影响及其控制
　　碳源，按菌体利用快慢而言，分为迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源。前者(如葡萄糖)能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解代谢产物(如丙酮酸等)，因此有利于菌体生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用；后者多数为聚合物(也有例外)，为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的生产期，也为许多微生物药物的发酵所采用。例如，乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油及半乳糖分别是青霉素、头孢菌素C、盐霉素、核黄素及生物碱发酵的最适碳源。因此选择最适碳源对提高代谢产物产量是很重要的。
　　在青霉素的早期研究中，就认识到了碳源的重要性。在迅速利用的葡萄糖培养基中，菌体生长良好，但青霉素合成量很少；相反，在缓慢利用的乳糖培养基中，青霉素的产量明显增加。糖对青霉素生物合成的影响见图7-8。由图可见，糖的缓慢利用是青霉素合成的关键因素。所以缓慢滴加葡萄糖以代替乳糖，仍然可以得到良好的结果。这就说明乳糖之所以是青霉素发酵的良好碳源，并不是它起着前体作用，只是它被缓慢利用的速度恰好适合青霉素合成的要求，其他抗生素发酵也有类似情况。在初级代谢中也有类似情况，如葡萄糖完全阻遏嗜热脂肪芽孢杆菌产生胞外生物素(属同效维生素，vitamer，化学构造及生理作用与天然维生素相类似的化合物)的合成。因此，控制使用能产生阻遏作用的迅速利用的碳源是非常重要的。在工业上，发酵培养基中常采用含迅速利用和缓慢利用的混合碳源，就是根据这个原理来控制菌体的生长和产物的合成。

图7-8糖对青霉素生物合成的影响试验
　 　碳源的浓度也有明显的影响。由于营养过于丰富所引起的菌体异常繁殖，对菌体的代谢、产物的合成及氧的传递都会产生不良的影响。若产生阻遏作用的迅速利用的碳源用量过大，则产物的合成会受到明显的抑制；反之，仅仅供给维持量的碳源，菌体生长和产物合成就都停止。所以控制合适的碳源浓度是非常重要的。如在产黄青霉Wis54-1255发酵中，给以维持量的葡萄糖[其比消耗速率0.022g／(g·h)]，菌的比生长速率和青霉素的比生成速率都为零，所以必须供给适量的葡萄糖，方能维持青霉素的合成速率。因此，控制适当的碳源浓度，对工业发酵是很重要的。
　　控制碳源的浓度，可采用经验法和动力学法，即在发酵过程中采用中间补料的方法来控制。这要根据不同代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方式。动力学方法是要根据菌体的比生长速率、糖比消耗速率及产物的比生成速率等动力学参数来控制。

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⒉氮源对发酵的影响及其控制
　　氮源有无机氮源和有机氮源两类。它们对菌体代谢都能产生明显的影响，不同的种类和不同的浓度都能影响产物合成的方向和产量。如谷氨酸发酵，当NH4+供应不足时，就促使形成α-酮戊二酸；过量的NH4+，反而促使谷氨酸转变成谷氨酰胺。控制适量的NH4+浓度，才能使谷氨酸产量达到最大。又如在研究螺旋霉素的生物合成中，发现无机铵盐不利于螺旋霉素的合成，而有机氮源(如鱼粉)则有利于其形成。
　　氮源像碳源一样，也有迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源。前者如氨基(或铵)态氮的氨基酸(或硫酸铵等)和玉米浆等；后者如黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等蛋白质。它们各有自己的作用，快速利用的氮源容易被菌体所利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。如链霉菌的竹桃霉素发酵中，采用促进菌体生长的铵盐浓度，能刺激菌丝生长，但抗生素产量下降。铵盐还对柱晶白霉素、螺旋霉素、泰洛星等的合成产生调节作用。缓慢利用的氮源对延长次级代谢产物的生产期、提高产物的产量是有好处的。但一次投入全量，也容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体过早衰老而自溶，从而缩短产物的生产期。综上所述，对微生物发酵来说，也要选择适当的氮源和浓度。
　　发酵培养基一般是选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。如氨基酸发酵用铵盐(硫酸铵或醋酸铵)和麸皮水解液、玉米浆；链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。但也有使用单一的铵盐或有机氮源(如黄豆饼粉)。它们被利用的情况与快速利用和慢速利用的碳源情况相似。为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶，除了基础培养基中的氮源外，还要在发酵过程中补加氮源来控制其浓度。生产上采用的方法有如下几种。
　　⑴补加有机氮源根据产生菌的代谢情况，可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源，如酵母粉、玉米浆、尿素等。如土霉素发酵中，补加酵母粉，可提高发酵单位；青霉素发酵中，后期出现糖利用缓慢、菌浓变稀、pH值下降的现象，补加生理碱性物质的尿素就可改善这种状况并提高发酵单位；氨基酸发酵中，也可补加作为氮源和pH值调节剂的尿素。
　　⑵补加无机氮源补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。氨水既可作为无机氮源，又可调节pH值。在抗生素发酵工业中，通氨是提高发酵产量的有效措施，如与其他条件相配合，有的抗生素的发酵单位可提高50％左右。但当pH值偏高而又需补氮时，就可补加生理酸性物质的硫酸铵，以达到提高氮含量和调节pH值的双重目的。还可补充其他无机氮源，但需根据发酵控制的要求来选择。

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⒊磷酸盐对发酵的影响及其控制
　　磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的。微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32～300mmol／L，但对次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol／L，提高到10mmol／L，就明显地抑制其合成。相比之下，菌体生长所允许的浓度比次级代谢产物合成所允许的浓度就大得多，两者平均相差几十倍至几百倍。因此控制磷酸盐浓度对微生物次级代谢产物发酵来说是非常重要的。磷酸盐浓度调节代谢产物合成机制，对于初级代谢产物合成的影响，往往是通过促进菌体生长而间接产生的，对于次级代谢产物来说，机制就比较复杂。
　　磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采用适当的浓度。对于初级代谢来说，要求不如次级代谢那么严格。对抗生素发酵来说，常常是采用生长亚适量(对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量)的磷酸盐浓度。其最适浓度取决于菌种特性、培养条件、培养基组成和来源等因素，即使同一种抗生素发酵，不同地区不同工厂所用的磷酸盐浓度也不一致，甚至相差很大。因此磷酸盐的最适浓度，必须结合当地的具体条件和使用的原材料进行实验确定。培养基中的磷含量，还可能因配制方法和灭菌条件不同，引起含量的变化。据报道，利用金霉素链霉菌949(S.aureofaciens949)进行四环素发酵，菌体生长最适的磷浓度为65～70μg／mL，而四环素合成最适磷浓度为25～30μg／mL。青霉素发酵，以用0.01％的磷酸二氢钾为好。在发酵过程中，有时发现代谢缓慢的情况，还可补加磷酸盐。在四环素发酵中，间歇、微量添加磷酸二氢钾，有利于提高四环素的产量。
　　除上述主要基质外，还有其他培养基成分影响发酵。如Cu2+，在以醋酸为碳源的培养基中，能促进谷氨酸产量的提高；Mn2+对芽孢杆菌合成杆菌肽等次级代谢产物具有特殊的作用，必须使用其足够的浓度才能促进杆菌肽的合成等。
　　总之，发酵过程中，控制基质的种类及其用量是非常重要的，是发酵能否成功的关键，必须根据产生菌的特性和各个产物合成的要求，进行深入细致的研究，方能取得良好的结果。

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第六节CO2和呼吸商
　 　二氧化碳(CO2)是微生物的代谢产物，同时，它也是合成产物所需的一种基质。对微生物生长和发酵具有刺激作用，它是细胞代谢的可贵指标。有人把细胞量与累积尾气CO2生成关联，把CO2生成作为一种手段，通过碳质量平衡来估算菌体生长速率和细胞量。溶解在发酵液中的CO2对氨基酸、抗生素等微生物发酵具有抑制和刺激作用，对许多产物的生产菌亦有影响。
一、CO2对菌体生长和产物形成的影响
　 　CO2对菌体的生长有直接作用，引起碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降。大量实验表明，CO2对生产过程具有抑制作用。当CO2分压为0.008MPa时，青霉素合成速度降低40％；发酵液中溶解CO2浓度为1.6×10-2mol／L时，会严重抑制酵母生长。当进气口CO2含量占混合气体体积的80％时，酵母活力只达到对照组的80％。一般以1L／(L·min)的空气流量通气发酵，发酵液中溶解CO2只达到抑制水平的10％。
　　当微生物生长受到抑制时，也阻碍了基质的异化（或分解代谢）和ATP的生成量，由此而影响产物的合成。在氨基糖苷类抗生素紫苏霉素(sisomycin)生产中，在300L发酵罐于空气进口通以1％CO2，发现微生物对基质的代谢极慢，菌丝增长速度降低，紫苏霉素的产量比对照组降低33％。通入2％CO2，紫苏霉素的产量比对比照组降低85％，CO2的含量超过3％，则不产生紫苏霉素。
　　CO2会影响产黄青霉菌(penicilliumchrysogenum)的形态。研究者将产黄青霉菌接种到溶解不同CO2浓度的培养基中，发现菌丝形态发生变化。CO2分压0～8％时，菌丝主要是丝状；CO2分压15％～22％，则膨胀，粗短的菌丝占优势；CO2为0.008MPa时，则出现球状或酵母状细胞，致使青霉素合成受阻，其比生成速率降低40％左右。
　　CO2对细胞作用机制是怎样的呢？CO2及HCO3-都会影响细胞膜结构，它们分别作用于细胞膜的不同位点。CO2主要作用在细胞膜的脂肪核心部位。HCO3-则影响磷脂，亲水头部带电荷表面及细胞膜表面的蛋白质。当细胞膜的脂质相中CO2浓度达临界值时，使膜的流动性及表面电荷密度发生变化，这将导致许多基质的膜运输受阻，影响细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，细胞生长受到抑制，形态发生改变。
　　CO2对发酵的影响很难进行估算和优化，估计在大规模发酵中CO2的作用将成为突出的问题。因发酵罐中CO2的分压是液体深度的函数，10m深的发酵罐在0.101MPa气压下操作，底部CO2分压是顶部CO2分压的2倍。为了排除CO2的影响，必须考虑CO2在培养液中的溶解度、温度及通气情况。CO2溶解度大，对菌生长不利。

生态无极

二、CO2的释放率
　 　分析尾气中CO2的含量，记录培养基体积及通气量的变化，用计算机计算CO2的积累量，与培养基培养菌体的干重比较，得出对数期菌体生长速率与CO2释放率成正比关系(一般空气进口O2占20.85％、CO2占0.03％、惰性气体79.12％)。如果连续测得排气氧和CO2浓度，可计算出整个发酵过程中CO2的释放率(Carbondioxidereleaseratio，简称CRR)。

式中——二氧化碳比释放率，mmolCO2／(g干菌体·h)；
c(X)——发酵液中菌体的浓度，g干菌体／L。
三、呼吸商与发酵的关系
　 　发酵过程中菌的耗氧速率OUR可通过热磁氧分析仪或质谱仪测量进气和排气中的氧含量计算而得，并最终计算出呼吸商RQ。

　 　RQ可以反映菌的代谢情况，酵母发酵，RQ=1，糖有氧代谢，仅生成菌体，无产物形成；RQ>1.1，糖经EMP生成乙醇。不同基质，菌的RQ不同。E.coli以延胡索酸为基质，RQ=1.44；以丙酮酸为基质，RQ=1.26；以琥珀酸为基质，RQ=1.12；以乳酸、葡萄糖为基质，RQ分别为1.02和1.00。
　　在抗生素发酵中，由于存在菌体生长、维持及产物形成的不同阶段，其RQ值也不一样。青霉素发酵的理论呼吸商：菌体生长0.909，菌体维持1，青霉素合成4。从上述情况看，发酵早期，主要是菌生长，RQ<1；过渡期菌体维持其生命活动，产物逐渐形成，基质葡萄糖的代谢不仅仅用于菌体生长，RQ比生长期略有增加。产物形成对RQ的影响较为明显，如产物还原性比基质大，RQ增加；产物氧化性比基质大，RQ就减少。其偏离程度决定于每单位菌体利用基质所形成的产物量。
　　实际生产中测定的RQ值明显低于理论值，说明发酵过程中存在着不完全氧化的中间代谢物和除葡萄糖以外的其他碳源。如发酵过程中加入消泡剂，由于它具有不饱和性和还原性，使RQ值低于葡萄糖为惟一碳源时RQ值。如试验结果表明，青霉素发酵中，RQ为0.5～0.7之间，且随葡萄糖与消泡剂加入量之比而波动。
　　RQ是碳-能源代谢情况的指示值。在碳-能源限制及供氧充分的情况下，碳-能源趋向于完全氧化，RQ应达到完全氧化的理论值，见表7-1。如果碳-能源过量及供氧不足，可能出现碳-能源不完全氧化的情况，从而造成RQ异常。
表7-1一些碳-能源基质的理论呼吸商