[推荐]食用菌制种技术

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(二)母种的转管繁殖
经各种方法分离培养获得的纯菌丝，确认为是优良的菌株，可移接于新的培养基上进行扩大繁殖，以便得到更多的母种。
1.母种的提纯 经不同方法分离获得的母种，常因操作不严或其他原因带进杂菌，以致所分离的菌种不纯或分离失败，故须进行提纯。提纯的方法有变更培养温度、不同培养基的比较和反复转管提纯等措施。
(1)温度的控制 一般杂菌在较高的温度下生长较快，应采用多次变更培养温度，观察是否有其他杂菌出现，如有杂菌在培养基上生长，须采取其它方法补救。
(2)不同培养基的比较 有些杂菌在某种培养基上不适宜其生长或生长受到抑制，但它并没有死亡，只是暂时处于被抑制状态或缓慢地生长，一旦移接到适宜生长的培养基上，杂菌就会立刻生长出来。所以在提纯时采用多种培养基移接培养后，就可以观察出所分离的菌种是否纯正。
(3)反复转管提纯法 一般杂菌菌丝比食用菌生长要慢，待母种萌发生长后，挑起尖端的少量菌丝进行转管培养，反复2～3次即可获得纯菌种。
2.母种转管培养 是将一支长满斜面培养基的试管在无菌操作下，分别接入多只试管中培养，一般每支母种可分移30～40支新的斜面试管。现以单一型菌丝类转管母种为例，介绍无菌操作的具体程序(图4—11)
(1)所用接种箱(室)，要预先清洗消毒，使其成为无菌状态。
(2)接种培养基及一切用具，也要预先放进接种箱(室)，经过消毒。
(3)工作人员洗手，换上消过毒的衣帽鞋，戴上口罩，带上菌种进入接种区
(4)将双手和菌种管外壁用75%酒精棉球涂擦。
(5)点燃酒精灯。
(6)将菌种和斜面培养基的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间的部分。斜面向上，并使它们位于水平位置。
(7)先将棉塞用右手拧转松动，以利接种时拔出。
(8)右手拿接种针(和拿钢笔一样)，在火焰上将凡在接种时可能进入试管的部分，全部用火烧过。
以下操作都要使试管口靠近火焰旁。
(9)用右手小指，无名指和手掌拔掉棉塞。
(10)以火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口(靠手腕的动作)，将试管口沾染的少量菌烧死。
(11)将烧过的接种针伸入菌种管内，先接触没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后轻轻接触菌种取出少许，将接种针抽出试管，不要使其碰到管壁。
(12)迅速将接种针在火焰旁伸进另一试管，接种于培养基中央。
(13)灼烧管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。
(14)放回接种针前，将其在火焰上再烧红灭菌。
整个过程应迅速准确。接种后每支试管上应贴上标签，注明种菇代号、转代次数、接种日期，以防混杂。然后放培养室(箱)中培养，培养温度20℃～22℃，空气相对湿度为60%～70%为宜，并要求有新鲜空气。
人工栽培的食用菌中，银耳和金耳属混合型菌丝类。银耳和金耳子实体的形成，必须有其他菌丝的帮助。银耳须有香灰菌丝的帮助，金耳须有粗毛硬草菌丝的帮助，二者缺一不可。这是因为银耳和金耳的纯菌丝体生长相当缓慢，分解木质素、纤维素能力极弱，分别要依赖于香灰菌丝和粗毛硬草菌丝分解基质，提供它们生长发育所需的养分，否则便形不成子实体。现以银耳为例介绍一种菌丝混合培养技术。
取纯银耳菌丝试管母种和新配制的PDA斜面试管各一支，连同接种器具一起放入接种室(箱)中，按无菌操作进行转接(图4—11)。挑取米粒大小、带培养基菌种一块，移接于空白试管斜面培养基上，加棉塞后置22℃～24℃下恒温培养6～8天。当银耳菌丝长至似绣球状如黄豆大小时，再连同香灰母种一起移入接种室(箱)里，按无菌操作用接种铲在距银耳纯菌丝团约2cm处，接入一小块香灰菌丝母种，培养2天在接种块上便可见到白色菌丝，7天左右即形成白毛团，12～15天在白毛团的上方可见到有红、黄色水珠。

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(三)母种质量鉴定
优良纯正的母种是食用菌栽培的基本保证，对分离、引进或转管扩大的菌种，须经过质量鉴定，取优去劣，方可使用。检验菌种质量常用的方法有以下几种：
1.测定菌丝的生长速度 将各种不同孢子萌发的菌丝，接种后在适宜温度湿度条件下，观察母种菌丝的生长速度和生长量。如菌丝生长快，绒毛状菌丝长短整齐一致，菌丝清晰、浓壮，并在培养基反面可以清晰地看到有一圈圈“年轮”似的菌环，菌丝密而均匀，这是优良母种的特征。不理想的母种，应淘汰不用。
2.测定菌丝对干、湿度的适应性 将母种移接于不同干、湿度培养基上，观察菌丝的生长情况。不同干、湿度的培养基，在配制时，应以琼脂的用量来控制。如在1000mL水的培养基中，分别加入15g，17g，20g的琼脂，就可得到偏湿、适中、偏干三种类型的培养基。菌丝在干、湿度不同的培养基上生长，有三种情况出现。有的适应性强；有的适于干的环境；有的适应于湿的环境。因此，应选择菌丝干、湿都适应性强的母种扩大繁殖，其余应弃去不用。
3.菌丝的高温锻炼 将分移的母种在适宜的温度(22℃)下培养一星期，然后将试管移入35℃的高温下锻炼半天，再回到适宜的温度下培养，如菌丝不干缩、不发黄倒毛，仍然生长旺盛，说明是耐高温性母种，可留作继续检验使用。其他不耐高温，生活力弱的母种，一般不予采用。
4.检验菌丝形态 将母种菌丝挑取少许放在载片上(应事先放好一滴清水)，然后盖上盖玻片，于显微镜下观察菌丝的形态。如菌丝是一条条有横隔的多细胞管状的，是蘑菇菌丝。若菌丝体无分隔或菌丝体上生有绿色或黄色等孢子的都是杂菌。
5.菌丝吃料鉴定 蘑菇菌丝经过以上几个方面测定后，初选出的优良母种接种在麦草培养基上，观察菌丝吃料生长情况。如接种后3天检查，菌种块即已萌发，周围长满绒毛状菌丝，并能搭上料；到第5天检查菌丝已明显吃料定植，到第8天菌丝已开始在料中向下生长。菌丝吃料后，培养料转色好，菌丝洁白浓壮，清晰有力，绒毛扇形菌丝多，这说明是优良的菌种，可作为入选检验。
6.出菇试验 母种质量的好坏，直接关系到原种、栽培种及大面积生长。所以在经过各种检验后，还必须做好出菇试验。试验时，将不同种菇的母种分别接于原种培养基上(菌丝吃料鉴定)，放在25℃温度下培养。当菌丝长到瓶底后，拔出棉塞，将瓶子上部敲掉，或将菌种挖出放在盆或钵里，愈合好的菌丝，分次覆上粗、细土，调好水分，置于14℃～16℃的恒温下培养，从中选择菌丝爬土快，穿土，性能好，菌丝浓壮，出菇快，菇体圆整、粗壮，色洁白，无锈斑，出菇多，转潮快，质量好的种菇的母种进行扩大培育，作为制原种用。无出菇能力或出菇不正常的母种一律淘汰不用。出菇试验最迟在12月底必须进行，以便发现问题及时补救，没有作出菇试验的母种，一律不能用于生产。

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(四)不同母种表型特征
1.双孢蘑菇 常见的有两种类型，一类是气生型，其菌丝直立白色，绒毛状，较密，较粗，爬壁能力强；另一类是贴生型，其菌丝匍匐，紧贴培养基，呈放射状生长，较细，较稀疏，呈蓝灰色，无爬管能力。双孢蘑菇的菌丝生长速度慢，一般需培养15天以上才能长满试管斜面。
2.香菇 菌丝洁白、细短、絮状，不产生色素，菌丝生长速度中等，一般12～14天可铺满试管斜面。
3.草菇 菌丝灰白色飞细长、稀疏而有光泽，似蚕丝，培养数天后产生厚垣孢子，呈链状，初期淡黄色，成熟后联结成深红褐色的团块。菌丝生长速度，陕，一般3～4天即可铺满斜面，爬壁能力强，可布满试管空间。
4.金针菇 菌丝灰白色、粗壮，后期产生粉状孢子。菌丝生长速度中等，一般10天左右可长满斜面，很容易长出金黄色小子实体。
5.平菇 菌丝洁白、浓密、长而粗壮，不产生色素。菌丝生长快，在适宜条件下，一般六天左右即可铺满试管斜面，而且爬管能力强，其气生菌丝可布满试管空间。
6.银耳 银耳菌种包括银耳菌和香灰菌。银耳菌常用的是酵母状芽孢菌种(由担孢子萌发而得)，在PDA培养基上，一般呈灰白色粘糊状，不能形成菌丝。在26℃条件下，移植后2～3天即可布满斜面。香灰菌在PDA培养基上，菌丝灰白色，呈棉絮状。在26℃条件下，一般4～5天即可布满斜面，同时分泌大量色素，可渗入培养基中，从而使培养基全部变成黑色。
将上两种菌混合，即得银耳母种。
7.木耳 接种后，先长出纤细透明的初级菌丝，结合后，变成较为粗壮的次级菌丝，呈棉絮状，生长旺盛，老熟后分泌褐色色素。不同品种色素的量和颜色的深浅不同。菌丝生长部位的培养基也因渗入可溶性色素而变色。有些菌丝可以产生次生分生孢子，从而使培养基表面复有一层粉状物。菌丝生长速度中等，一般10天左右可长满试管斜面。
8.猴头 菌丝白色，紧贴培养基，常呈点片状或星芒形。菌丝生长速度慢，一般14～15天才能长满试管斜面，且极易产生小猴头。
9. 竹荪 菌丝白色、粗壮、浓密、呈绒毛状，生长旺盛，有爬管现象，后期菌丝粉状呈红色或紫红色。生长速度很慢，一般需培养26—45天才能长满斜面。
10.灵芝 菌丝白色、纤细、较密、呈棉絮状，匍匐生长，易形成菌膜，有韧性。生长速度中等，一般需培养10天左右布满斜面。
11.茯苓 菌丝灰白、粗壮、浓密，菌落有同心环，气生菌丝出现时即消失，生长旺盛，有爬管现象。生长速度快，培养7天左右布满斜面。

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二、原种和栽培种的培养
由母种扩大繁殖到玻璃瓶内或塑料袋内，通称原种；由原种再扩大繁殖，应用于生产的叫栽培种。其制作过程如下：
(一)接种前的准备工作
接种、操作一般应在经消毒的无菌条件下进行，先作空箱消毒，然后将灭过菌的菌种料、瓶及接用菌种的接种用具，用高锰酸钾溶液揩拭表面尘物，放入接种箱(室)内，用5%石炭酸或0.25%新洁尔灭药液在接种箱(室)内各处喷雾，再进行消毒灭菌。目前最常用的灭菌方法有甲醛薰蒸和紫外线两种(见前)。
(二)接种方法
1.常规接种法 接种时，先点燃酒精灯，将接种用具、菌种表面、接种人员双手用75%酒精擦抹，再将接种针或镊子、菌种棉塞在火焰上灼烧消毒，然后在火焰上将管(瓶)口棉塞轻轻拔出，斜对火焰，就可进行正式接种。接原种时将每支母种斜面用接种针横划成4～5段，每瓶原种培养基接入一段(图4—12)；接栽培种时，每个培养基瓶内用镊子挟入一小块原种，即每瓶原种一般可接栽培种30～40瓶或40～50瓶(图4—13)。
原种和栽培种的接种操作除按母种接种方法外，还应注意下列事项。
(1)接种时箱(室)内温度不要超过32℃。因此，夏季接种时，应在晚上或清晨进行，以免影响菌种生活力。
(2)被接菌种要求健壮、生命力强、无杂菌和虫害。如瓶内出现有子实体或茶褐色菌膜时，只要不接触棉塞，将其去掉，并不影响菌种质量。
(3)接栽培种时，应将原种上部培养基块和少量料种去掉不用，以减少杂菌污染。
(4)接种块菌丝不能损伤过大或过碎，菌种块要接在瓶口中央。特别是接银耳栽培种时，如接种块过碎，形成子实体多，养分分散，朵形小，质量差；如果是整块，子实体只形成一个，营养集中，朵形大，质量好。
(5)接种箱操作时间一般不宜超过35分钟。特别是气温高时，如接种日引司过长，温度升高，菌种生活力减弱。
(6)接种工作完毕后，应及时送入培养室培养，并做好标签记录，防止混乱。
2.两点接种法 生产食用菌的原种或栽培种，从接种培养到菌丝长满全瓶，一般都要25～40天，特别是原种生长更慢。而且同一瓶里不同部位菌丝的菌龄相差悬殊，活力也有差异。根据真菌菌丝从接种点向周围呈球形状扩展的特点，采用两点法接种，可使菌丝提早1／3～1／2的时间长满全瓶，即节约了时间，又可使瓶内菌龄较为一致，活力也强。具体方法为：把常规的木屑麸皮等培养基装瓶后，用特制的打孔木棒在培养基中央打孔，灭菌操作均按常规进行。
接种时，先用接种铲将斜面横切成大致相等的5—6段，上部稍长，下部稍短(因下部培养基较厚)，再用接种刀将各段纵切成两块。用接种钩或接种铲取一菌块，放入培养基内接种穴下部，再取一块放在培养基上面即可(图4—14)。
栽培种的接种，最好由两人操作，方法类似原种接种，不同者是接种工具为镊子或接种匙，在瓶中接两个点；若将整个中心孔接满成为柱状，则生长更快。
3.栽培种的简易生产法 对一些适应性强，菌丝生长快的菇类如平菇、凤尾菇、草菇等也可用子实体直接繁殖栽培种或用生料生产栽培种。
(1)菇体繁殖栽培种 用子实体组织直接接种生产菌种，方法简便，时间短，遗传性稳定。在缺乏原种的条件下，可作为生产栽培种的一种应急措施。
方法是把表面消毒的子实体(未释放孢子)，削掉菌柄表皮，切成0.5立方厘米大(如蚕豆大小)小块，取一块接入已灭菌的培养基内，在适宜温度下(23℃～25℃)
培养20～25天，待瓶内培养基布满白色菌丝，即可使用。每公斤平菇菌种可接80～100瓶栽培种。
(2)生料栽培种制法 在燃料缺乏的地方，生产平菇栽培种可采用此法。
方法是选择新鲜无霉变的棉籽壳，先在阳光下曝晒2～3天。然后加入0.1%的多菌灵(粉剂，先用少量酒精调成糊状)，1%～3%的石灰水与料拌匀，装入事先经高锰酸钾、酒精消毒过的瓶内或塑料袋内。夹取原种块接入生料菌种瓶或袋内，接种时可分层或表面接种均可，但接种量要大(比熟料大3～4倍)，也可用10%～15%的种量与生料培养基拌匀后装瓶或袋，置适温下培养(一般不超过20℃)，约一个月左右，菌丝布满培养料即可使用。
(三)接种后的培养管理
原种和栽培种的培育过程中应注意以下几点：
1.培养温度 一般放置22℃～23℃的温度下培养，30～45天就可长满瓶。
2.培养湿度 室内相对湿度保持在60%～70%之间，经常保持室内空气新鲜，以利菌丝的生长。如多雨季节室内空气湿度过大，应在地面上撒些石灰粉，降低湿度，防止病虫杂菌孳生。
3.菌种瓶直立放置 因接入的菌种块还未生长固定，如卧倒叠放，菌种块易落到瓶侧，影响发菌。如生产菌种数量多，应待菌丝已封口伸入料中后，便可横放，以充分利用空间面积。
4.检查去杂 从第3天开始就要经常检查有无杂菌污染，发现有杂菌的要及时处理，一般检查工作继续到菌丝体覆盖整个培养基表面为止。
5.保持清洁卫生 培养室内外要经常保持清洁卫生，同时培育期间每隔7～10天，在室内外及瓶口棉塞上喷1%的敌敌畏或其他杀虫药液一次，防止害虫发生。
另外，在培养麦粒菌种时，接种后7天左右应将菌种瓶摇动一次，使菌丝生长分布均匀；在培养银耳菌种时，有些瓶内木屑表面会看到有浅黄色的凸起糊状小菌落，它是芽孢，并非杂菌。

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三、菌种的编号与记载
为了使栽培者和使用者充分了解菌种情况，以及便于菌种生产者自己分类管理，生产出的试管或菌种瓶上应及时贴上一张标签。注明菌种名称、编号、来源(有性繁殖或无性繁殖)、代数和移接日期。通常用一些明确、统一的符号表示。习惯上将食用菌名称用该食用菌拉丁文学名的第一或前两个字母表示：如L(香菇)，Ag(蘑菇)，V(草菇)，PL(平菇)，FL(金针菇)，Au(黑木耳)，Tr(银耳)，Po(茯苓)，H(猴头)，G(灵芝)。有性繁殖多指孢子分离，用S表示。无性繁殖中，利用菇(耳)子实体组织分离的用T表示，利用基内菌丝分离的用M表示，转管移接用F表示，最后一次移接时间用数字来表示。例如要表示1990年用孢子分离得到的黑木耳菌种，编号为18，转管移接7次，最后一次转管移接时间为1992年5月1日，这么多内容，可用图4—15来表示：

Au	1990	018
S	F7	920501
单 位

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四、液体菌种的制作与使用
液体菌种是用液体培养基培养而成的菌种。近年来，国内外正积极研究液体菌种的培养与利用。与固体菌种相比，它具有菌种生产周期短、菌龄整齐一致、接种方便、接于固体菌料发酵快、适宜于工厂化生产等优点，因而受到了广大栽培者的欢迎。目前我国已能进行深层发酵的食用菌有：香菇、平菇、凤尾菇、美味侧耳、鲍鱼菇、金针菇、银耳、黑木耳、猴头、草菇、蜜环菌、茯苓、滑菇和冬虫夏草等，其中应用最多的是香菇和平菇。
(一)液体菌种的培养方法
常见的有采用摇床来生产的摇瓶培养法和采用发酵罐来生产的深层培养法。若少量生产，可以用摇瓶培养法。深层培养需要一整套工业发酵设备，如锅炉、空气压缩机、空气净化系统、发酵罐等，故投资大，只适用于工厂化的大规模生产。而摇瓶培养投资少，设备技术简单，适合一般菌种厂生产使用。本节主要介绍摇瓶培养的技术方法。
1.液体菌种培养基配方
(1)葡萄糖 3% 豆 粉 2%
玉米粉 1% 硫酸镁 0.05%
磷酸二氢钾 0.1% 酵母粉 0.5%
　　其余为水 pH值 自然
本配方适用于多种食用菌的液体培养。
(2)可溶性淀粉 3～6% 蔗糖 1%
硫酸镁 0.15% 酵母膏 0.1%
其余为水 pH值调至6
本配方适用于平菇、香菇、草菇、猴头和黑木耳等的液体培养。
(3)玉米淀粉 3% 磷酸二氢钾 0.1%
玉米浆 1.2% 硫酸镁 0.07%
其余为水 pH值调至5
本配方适用于香菇。
(4)玉米粉 50g 麦芽汁 100ml
琼脂 0.5g 维生素B1 100ug
水 850ml pH值自然
本配方适用于平菇。
2.摇瓶振荡培养技术
培养液配制好后，装入500mL容量的三角烧瓶中，每瓶装量为100mL，并加工0～15粒小玻璃珠，加棉塞后再包扎牛皮纸封口，在1.5kg/cm2压力下灭菌30分钟，取出冷却到30℃以下时，接入一块约2平方厘米的斜面菌种，于23℃～25℃下静置培养48小时，再置往复式摇床上振荡培养，振荡频率为80～100次/分，振幅6cm～10cm。如果用旋转式摇床，振荡频率为200～220转／分。摇床室温控制在24℃～25℃，培养时间因菌类不同而异，一般是在7天左右。培养结束的标准是：培养液清澈透明，液中悬浮着大量小菌丝球，并伴有各种菇类特有的香味。
(二)液体菌种的检验方法
对液体菌种进行检验可采用感官检查和取样测验相结合的方法。
1.感官检查 可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查。
看：将样品静置桌上观察。一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液呈黄色或黄褐色，清澈透明，菌丝颜色因菌种而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明。二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状或棒状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清。三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液体菌种，在瓶中所占比例可达80%左右。四看pH值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH值到达4.0左右，为发酵点；如果在24小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变。五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线。
旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点。醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用。菌丝的悬浮力好，放置5分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡。再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌。
嗅：在旋转样品后，打开瓶盖嗅气味。培养好的优质液体菌种，均具有芳香气味；而染杂菌的培养液则散发出酸、甜、霉、臭等各种异味。
2.取样测验 可取液体菌种进行称重检查和粘度检查；生长力测定和出菇试验；化学检查，包括测pH值、糖含量和氧含量等；显微检查，包括细胞分裂状态观察、普通染色和特殊染色等。
(三)液体菌种 的使用方法
液体菌种可作原种使用，也可作栽培使用。
1.作原种 取一支100ml。兽用注射器，去掉针尖，换一根内径1mm～2mm，长100mm～120mm的不锈钢钢管，制成一个菌种接种器。使用前，洗净接种器并用纱布包好，经高压蒸汽灭菌，冷却后抽取液体菌种即可进行接种。
经灭菌待接入菌种的原种瓶，先要在无菌条件下去掉棉塞，并改换无菌薄膜包扎瓶口。接种时，将针管插入瓶口上的薄膜，每瓶接种量为10mL～１5ml，要注意使液体菌种均匀分布在培养基表面，拔出针管后要立即用胶布贴封针孔，竖放在培养室的床架上进行培养。
2.作栽培种 液体菌种在作栽培使用时，瓶栽的每瓶接种量为10mL～15mL；开放式床栽的，每平方米接种量为500mL～1000mL，不需要接种针筒，可直接均匀洒在培养料面，或进行穴播。

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菌种保藏
菌种是重要的食用菌生产资料，必须很好保藏，做到不死亡，不衰退，不被杂菌污染，才能在生产上长期使用。保藏菌种的基本原理是使菌丝的生理代谢活动尽量降低，甚至进入休眠状态。通常采用的手段是：低温、干燥和减少氧气供应。
一、斜面低温保藏
这是一种常用的而且是最简便的保藏方法。首先将要保藏的菌种移接到适宜的斜面培养基上。一般采用营养丰富的半合成培养基，如PDA培养基，麦芽汁琼脂培养基等。为了减少培养基水分蒸发，延长保藏时间，可将琼脂用量加到20.5%。在这些培养基中，最好再加入少许0.2%的K2HP04、KH2PO4、CaCO3等缓冲剂，以中和菌种在保藏过程中产生积累的有机酸。如果是保藏香菇和黑木耳菌种，应把配方中的葡萄糖换成麦芽糖。用适宜温度培养至菌丝长满斜面，选择菌丝生长健壮的试管，先用硫酸纸包扎好管口棉塞，再将若干支试管用牛皮纸包好。现在提倡用无菌胶塞代替棉塞，既可防止污染，又可隔绝氧气，避免斜面干燥。具体做法是：选择大小合适的橡皮胶塞，洗净晾干，在75%酒精液中杀菌一小时，用无菌纱布吸去酒精，在火焰上烧去残留的酒精液。于无菌条件下，将试管口在火焰上灼烧灭菌，拔去棉塞，换上胶塞，再用石蜡密封。放入4℃左右的电冰箱内保存。每隔3～4个月转管一次。如果用胶塞石蜡封口，转管期可延迟至6个月。草菇菌种不耐低温，菌丝在5℃以下就死亡。保藏温度应捉高到10℃～15℃。
二、液体石蜡保藏
将要保藏的菌种接入前面介绍的马铃薯半合成培养基(3)上，培养至菌丝长满斜面，选择生长健壮的备用。然后选用化学纯的液体石蜡装入三角瓶内，装至瓶体的１/3处，塞上棉塞后包扎，１kg/cm2灭菌１小时。灭菌后，放在40℃恒温箱中，使水分蒸发至石蜡液透明为止。冷却后在无菌箱(室)内，以无菌操作方法，用无菌吸管分别注入待保存的各个试管菌种内，注入量以淹过斜面1cm为宜。然后塞以橡皮胶塞，用蜡封口，直立于试管架上，放入4℃冰箱中或常温下保藏(图4—1 6)。此法可保藏5～7年，但最好1～2年移植一次。使用时，不必倒去石蜡油，只要用接种针从斜面上挑取小块菌丝即可(但要尽量少带石蜡油)。余下的母种可继续保藏。由于挑出移接的菌丝块沾有石蜡，故生长微弱，必须转接几次才能恢复正常。
三、孢子滤纸保藏
本法是将食用菌孢子吸附在滤纸上，干燥后再行低温保藏。操作简便，效果也较理想。将滤纸剪成4cm X 0.8cm小条，整齐平铺在直径为9cm的培养皿中，用纸包好，1kg/cm2灭菌30分钟。另取变色硅胶数粒。放在干净试管内，塞上棉塞，随同滤纸一起灭菌。灭菌后，将其放在80℃烘箱中烘烤1小时备用。然后在无菌箱中，把消毒种菇(蘑菇等有菌幕包裹的食用菌在0.1%升汞水中泡1～2分钟，平菇等无菌幕包裹食用菌用75%酒精棉球擦试)插在无菌支架上，支架放在铺有滤纸条并经灭菌的培养皿内，罩上无菌玻璃钟罩，在200℃～25℃下经1～2天，滤纸条上即落满孢子。以无菌操作移去种菇，摄取落有孢子的滤纸条，别装入放硅胶的无菌试管中，再置干燥器中l～2天，充分干燥后，用火焰熔封试管口，即制成滤纸条保藏管，贴好标签，置低温下保藏(图4—17)，一般可保存2～4年。需用时，先用砂轮在管壁外划痕，再在划痕外稍加热，然后用浸有来苏儿的湿布敷上，管壁即自动破裂，此时以无菌操作摄取滤纸条，将有孢子的一面贴在培养基上，于适温下培养一周左右，即可观察到孢子萌发和菌丝生长状况。

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四、蒸馏水保藏
这是一种简易的菌种保藏法。取蒸馏水，装入三角烧瓶中，装量约为瓶体积的l/3，加上棉塞，同时准备好与三角瓶口径一致并带虹吸管的橡皮塞，用纸包好，一起置1.5kg/cm2压力下灭菌30分钟备用。若用于保藏孢子，则可将蒸馏水装入试管，每管装置5mL，经灭菌后备用。
在接种室(箱)内，将经灭菌盛有蒸馏水的三角瓶口的棉塞换上带虹吸管的橡皮塞，即可按无菌操作法将无菌蒸馏水注入欲保藏的试管菌种中，水量以高出斜面培养基面约1cm为宜，最后将棉塞改用经灭菌的橡皮塞即成。如欲保存孢子，则可按常规法采集孢子，挑入装有蒸馏水经灭菌的试管中，然后加盖经灭菌的橡皮塞，置试管架上。上述两种菌种都要直立于常温或低温下保存。
使用时可直接从管内移出菌丝块或用接种环沾取孢子悬液，接入新培养基上进行培养，剩下部分仍可加塞封好保藏。
五、自然基质保藏
自然基质的种类很多，这里主要介绍粪草和木屑两种保藏法。
1.发酵粪草保藏法 草腐型菌可用此法保藏，但草菇因不耐低温不能放置冰箱内保藏。
取蘑培栽培用的发酵培养料，晒干除去粪块，将料草剪成2cm左右长，在清水中浸泡4～5小时，让料草被水浸透，然后取出，挤去多余的水分，使料基含水量在68%左右。装进20mmX200mm试管，要松紧适当。装好后清洗管壁，塞上棉塞，在1.5kg/cm2力下灭菌2小时，冷却后，接入要保藏的菌种，在250℃下培养。菌丝长满培养基后，以无菌操作换上灭菌橡胶塞并蜡封，放在冰箱(2℃)中保藏，两年转管一次。
2.木屑保藏法 此法适合于木腐菌。配方为阔叶树木屑78%，米糖20%，石膏1%，蔗糖1%，水120%，将配料装入18mm x l80mm试管中，1.5kg/cm2灭菌1.5小时。冷却后，接入要保藏的菌种，在25℃下培养，待菌丝长满木屑培养基时，取出，在无菌室内换上灭菌橡皮塞，放冰箱(3℃)保藏，l～2年转管一次。
另外，有条件的单位可用液态氮超低温保藏法。它的优点是：保存时间可长达数年至数十年；适应范围广，对一些不耐低温菌种，如草菇等，也可在保护剂的保护下进行超低温保存；此法保藏的菌种基本上不发生变异。液态超低温保藏，是目前保藏菌种的最好方法，但由于液态低温冰箱价格昂贵，液氮的来源较困难，所以目前国内应用还不普遍，故本书不作详细介绍。
六、原种和栽培种短期保存
原种和栽培种，一般都应按计划生产，长好后及时使用，不宜长期保藏，只能作短期保存。它体积大，数量多，不可能放在冰箱内大量保存。再说保藏的时间长了也会影响其生活能力。但是自己生产或购来的原种和栽培种，往往不可能马上就用，也得进行短时间的保存。
要保存的原种，必须菌丝粗壮，生活力强，瓶盖严密，无杂菌感染。要保存的栽培种，必须菌丝茁壮，菌柱不应与瓶壁分离，不得有污染或出黄水的衰老现象。
把挑出的符合保存标准的原种和栽培种，放入保存室内。保存室的条件应该是：干净、凉爽、干燥、黑暗，以降低其生命活动，减少变异退化。温度以5℃～10℃为宜。不要超过15℃，也不能低于0℃。在这样的条件下，原种和栽培种可保存2～3个月。温度越高，保存的时间越短。

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简易制种方法
前面介绍了常规的制种方法，现根据山西师大生物系段存礼同志在生产实践中摸索的经验，介绍两种简易的制种技术方法：
一、能够多次重复使用的菌种制作与使用技术
食用菌制种一般需要经过一、二、三级种。逐步扩接，周期长、速度慢，菌种制好后只能使用一次，具每次接种都要用新菌种。而本方法制一次菌种，可以反复多次利用。在接种后，当菌丝长到—定长度，深入到培养基中长牢固后，取出菌种，反复利用多次，菌种不老化，不衰退，萌发能力强，出菇快，产量高，达到制种简化，栽培快速的目的。
(一)选材
多次反复使用的菌种培养材料，应该硬实，耐蒸煮，不软化，易接种，菌丝生长迅速、壮实。为此所选的材料多为营养丰富的偏硬质材料，既不过分疏松，又不过分致密；既利用菌丝长入材料，又能保持材料的硬度及菌丝的牢固程度。可选择如下材料：
1.竹木原料 如利用饭店一次性使用的竹筷、木筷或利于菌丝生长的杨柳木、榆木、果园的苹果树、桃树、杏树枝及木材厂的边角料加工后使用。
2.秸杆或茎杆 选硬实的使用，用时周边打孔。
3.粗壮的木质化藤蔓 如葡萄藤、紫藤、猕猴桃藤、木通等。
4.硬实粗壮、营养丰富的树根。
(二)加工定型
根据需要，可把合适的材料经过切、削、钻等方法加工成合适长度及大小的条、片、块，可打眼、划沟、开槽。大小以栽培的培养料而定。条的长短可按用途而定。箱栽，床栽，地沟栽，条长2～5寸。袋栽条长6～7寸；直插可短，斜插可长；从袋外横插可短，袋内直插可长。其中一端较尖，利于插入。表面光滑的开纵沟2～3条或打孔。不同季节，不同栽培方法可自行确定。
(三)菌种制作与使用方法
将选好的定型料(干的或鲜的)，先经表面消毒处理，即将料面用水洗净或湿润，有的可先去皮，沥去多余的水分，拌入高锰酸钾干粉至料面呈深红色，保持10～15 分钟，利用其强氧化作用杀灭病菌。将表面已消毒的原料，放在营养液中浸煮，鲜料可以立即煮，干料最好浸6～12小时再煮，以增加营养。营养液可自行确定或选用下列配方：
配方l: 1.0%土豆汁 l%～10%白糖 0.2%～0.4%尿素
0.2%～0.4%磷酸二氢钾 0.1ppm～0.5ppm三十烷醇
0.1%～0.3%的硫酸镁、硫酸锌、牛肉膏、蛋白胨、酵母汁
配方2： 1%～10%葡萄糖或蔗糖 0.1ppm～0.5ppm三十烷醇
5ppm～20ppm萘乙酸 100ppm～500ppm比久(B9)
0.1ppm稀土 0.2石灰水上清液
用上述配方溶液将材料浸泡后，煮20～30分钟。干料可稍多加水，鲜料少加水。煮至近干。余水可用于拌和中间填缝用的绵子皮等材料。
取出煮好的木条(或其它材料)，混合拌好的棉子皮等填充材料装袋或装瓶。装好后高压或常压灭菌。高压121℃30～40分钟。常压100℃～105℃，即用大火蒸4小时后，保持摄氏度100℃12小时。冷至200C～28℃接种，按常规发菌。
菌丝长满后过几天，即可作菌种用。木条中接入的菌种，最好选用一级优良菌种。长成后的木条当二级种使用。一级种少时，也可接入二级种，长成后当三级种使用。
制种或栽培时，把发好菌丝的木条种接入已消毒并降温至28℃～30℃的培养料中，木条较长较粗时从袋一端插入一根即可，也可以从两端同时插入则发菌更快。从袋外插入木条种后，余下的插入孔内可填充废棉，以利于通气防杂菌，也可以外套另一个大塑料袋，通气防菌。当菌丝长入料内稳固后，即可取出木条菌种，再插入下一批消毒好并降温的培养料内。如果下批料未备好，可暂时不取出。
这种多次反复使用的木条菌种，其优点如下；
1. 木条长，菌种量大，袋内上下同时发菌，菌种离料底近，菌丝满袋快，全袋菌一致，菌丝同步，不老化，保证出菇优良，产量高。
2. 接种便利，菌丝不用重新愈合，接种面积大，通气好，生长快。
3. 木条种是由一级或二级种经一次扩种所得，避免了转管或转接次数增加所带来的老化、退化现象。这样的菌种生活力强，发菌快，产量高。木条一直使用能保持原来菌种的优良特性，可以连续使用多次直至木质较松为止。
4. 木条也可用于保存菌种，特别是没有冰箱的农村保种时更为重要。保种用的木条营养应少，以免菌丝太旺，消耗过多，而用于接种用的木条菌种则需加大营养使菌丝复壮。
5. 由于木条种可以连续使用，所以一次制种可供长年大批量生产，连续用种，省时省工省燃料省材料，也节约制种场地，并且使用时简单方便。可袋内插，也可袋外插；可用于袋栽，也可用于墙栽、箱栽、床栽、地沟栽、阳畦栽；可用于碎料栽，也可用于整捆秸杆、树枝栽培时插入。发菌快速，菌龄一致，抗污染力强，并且宜于用高抗污剂、抗霉剂处理原材料。

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二、新鲜幼嫩子实体直接制种法
食用菌生产者往往选用第一批大型高产食用菌子实体制种，所取部位往往是菇盖与菇柄交界处，肉厚、污染少、成功率高。但用新幼嫩的子实体制种比七、八成熟的大型子实体制种菌种，质量更好，产量更高。
1. 大型子实体菇蕾制种法 平菇、猴头菇、灵芝等子实体较大，厚实，选取第一批出菇、菇丛大小合适、形态完整、丛菇或单菇的菇蕾，不用消毒，直接撕开，取中心未污染部分组织，如豆粒大，放入试管予先制好的培养基上制种。蘑菇、草菇选种时往往选用单菇。制种后进行记录，然后观察菇丝的生长情况以决定取舍。每个菇蕾一般只作1～2管菌种，生长良好的菌种保留。
2. 薄形子实体幼蕾制种法 银耳、金耳、黑木耳等，耳片薄，制作菌种不容易，取基部制作也不方便，而在幼蕾期相对厚实，制种容易，生长好。取幼蕾内部未污染部分组织制种即可。特别是选有伴生菌的银耳幼蕾时制种，可连同伴生菌同时取上，一并制种更为方便。在幼蕾时，金耳可以看到金耳与伴生菌有明显的分界线，同时选取共同制种比较容易。