[推荐]食用菌制种技术

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(四)接种室和接种箱的操作规程
要想达到无菌操作的目的，必须严格在接种室和接种箱的操作规程。
1.接种室的使用规程
(1)在每次使用前半小时，把所需要的器材搬入缓冲室，在接种室和缓冲室用5%石炭酸溶液喷雾后，开启紫外线灯照射半小时。
(2)进入缓冲室，穿上无菌工作服、鞋、戴好口罩、工作帽，然后用2%煤酚皂液将手浸洗2分钟。
(3)将所需物品移入接种室，按一定位置摆好，检查是否齐全，并用5%石炭酸溶液重点在工作台的上方和附近的地面上喷雾，然后退回缓冲室，待几分钟后再进入接种室工作。
(4)接种前，用70%的酒精棉球擦手，然后按常规在火焰上进行各项操作。操作时动作要轻捷，尽量减少空气波动，两人操作时要配合默契。用毕的火柴杆，废纸不要扔在地上，应放在专用的瓷盆里。
(5)工作结束，及时取出接种材料，然后清理台面，将废物拿出室外，再用5%石炭酸全面喷洒，或打开紫外线灯照射半小时。
(6)接种时如遇棉塞着火，用手紧握即可熄灭，或用湿布扑灭，切勿用嘴吹灭，以免扩大火焰。如遇培养物或有菌容器打碎散落，应及时用揩布沾上5%的石炭酸溶液，收拾擦拭，再用酒精棉球擦手后才可继续操作。
2.接种箱的使用规程
(1)每次接种前用5%石炭酸在接种箱内壁和空间喷雾。
(2)用肥皂洗手后搬进接种物品，关闭箱门，开启紫外线杀菌灯照射20～30分钟。
(3)用70%酒精棉球擦手，然后伸进接种箱内操作。
(4)操作完毕要及时清扫掉落在箱内的培养物和火柴梗、棉球等杂物，并用2%来苏儿擦拭，再用5%石炭酸全面喷雾后关闭。
(五)玻璃器皿的洗涤与灭菌
为了保证制种工作的顺利进行，提高制种成品率，应首先对玻璃器皿进行严格的洗涤和灭菌。
1.洗涤时应注意的事项与方法
(1)洗涤玻璃器皿不能使用对其有腐蚀作用的化学药品，也不能使用比其硬度大的物品来擦拭，以免损伤玻璃器皿。
(2)新的玻璃器皿因附有游离碱，不能直接使用，应先在1%～2%的盐酸溶液中浸泡10个小时，再用清水冲洗干净备用。
(3)对用过的器皿应立即洗涤，久置会增加洗涤的困难。洗涤时要分类进行，以免浪费洗涤药剂和洗涤时间；对附有琼脂培养基的器皿，应先用水蒸煮融化后趁热倒出，再用清水洗涤；对沾有蜡的器皿，应先加热使之融化后擦掉，再用清水冲洗干净；对沾有焦油、树脂的器皿，可用40%氢氧化钠溶液洗涤。
(4)对清洁度要求较高的玻璃器皿，除用以上方法刷洗外，还应在洗涤液中浸泡数小时，用竹夹子取出(切勿用手取)，自来水冲洗干净，直至四壁能被水均匀湿润而无水珠时，说明油污已被除净，再用蒸馏水冲2～3次，即可烘干备用。
2.玻璃器皿的灭菌 玻璃器皿一般采用干热灭菌，若用高压蒸汽灭菌，灭菌后则要经过干燥才能使用。具体的灭菌方法前已述及，这里主要介绍常用玻璃器皿灭菌前的准备工作。
(1)培养皿 洗净后烘干或晾干，然后按每5～7套用牛皮纸或报纸包好，也可装在大饭盒或特制的盒内，即可灭菌。
(2)试管和三角瓶 洗净后烘干或晾干，灭菌前要在管口和瓶口加上棉塞，再用报纸包好。试管也可若干支扎在一起，棉塞外再包一层报纸。
(3)移液管和滴管 洗净后烘干或晾干，在口吸的一端用尖头镊子或针塞入少许脱脂棉花，以防菌体吸入口中而进入培养基内造成污染。塞好后用酒精灯火焰将露在管口外的棉花烧掉，然后用4cm～5cm宽的报纸条，以45度角螺旋形将每根移液管分别卷好，两端不可外露，再根据需要将若干支扎成一束，即可灭菌。使用时可从移液管中间拧断纸条抽取。滴管灭菌前的包装与移液管相同。
如果采用高压蒸汽锅灭菌，灭菌结束停止加热后，要立即排尽蒸汽，打开锅盖，再将锅内剩余的水排出，然后利用锅内的余热将器皿烘干。

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三、消毒与灭菌的效果检验
消毒与灭菌的效果，直接影响菌种成品率的高低。因此不但要把好消毒灭菌关，而且还要严格执行检验制度。
(一)培养基灭菌效果的检查
每采用一种新的培养基，或使用一种新的灭菌设备，以及变更灭菌的压力和时间，都必须进行灭菌效果的检验。具体方法是：把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管(瓶)，标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果某一位置的培养基出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，或锅的结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。
(二)接种室(箱)消毒灭菌效果的检验
1.检查方法 常用的检查方法有平板法和斜面法两种
(1)平板法 用常规培养基如肉汤琼脂，马铃薯葡萄糖琼脂等，分别倒成平板，每种两个，放入接种室或接种箱。检验时，按无菌操作各将其中一个平板的盖子打开，经过预定时间再盖好；另外一个不开盖子作为对照。然后一起放在30℃下培养48小时后检查有无菌落出现。
(2)斜面法 将以上的常规培养基斜面各取2管，放入接种室或接种箱。按无菌操作各将其中一管棉塞打开，把棉塞放入灭菌的培养皿内，经过一定时间再将棉塞塞好，连同对照一起放入培养室培养，温度和时间同前。
2.检验内容
(1)空气熏蒸效果检验 接种室(箱)用福尔马林或其他药剂熏蒸后，在开始使用前半小时打开培养皿(或试管棉塞)，至使用时盖(塞)好。
(2)紫外线灯灭菌效果检验 接种室或接种箱用紫外线灯照射后，分别在不同的高度和不同的位置用前面的方法检验空气中的杂菌，以判断紫外线灯的灭菌效果。必要时调整紫外线灯的照射时间或悬挂高度，或更换新的灯管。
(3)操作过程中空气污染情况检验 为了检验在使用接种室过程中，由于人员进出、器材搬放、操作动作等原因造成的空气污染，可在准备工作结束后，接种操作开始时打开盖子，经过5分钟、30分钟或直到工作结束时再盖好，以检验在不同使用时间内空气的污染程度。
3.检验结果分析 检验用的平板或斜面在30℃下培养48小时后取出观察。根据是否长菌落和菌落的数量、菌落的形态，来判断空气污染的程度和杂菌的种类。一般要求平板开盖5分钟者不超过3个菌落；斜面开塞30分钟者不长菌落。若所长的菌落超过这个数字，应考虑采取有效措施提高灭菌效果或改进操作方法。如菌落中霉菌较多，则可采用乳酸和福尔马林交替熏蒸的办法。

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菌种培养基
根据食用菌对营养、水分和酸碱度的要求配制而成的培养料为培养基。它是食用菌生长发育的营养物质，亦称基质。
一、培养基的配制原则
(一)培养基原料的选择
在菌种制备过程中，从母种、原种至栽培种，各个阶段的目的要求有所不同，所选用的培养基的配比也应有所区别。母种初生菌丝一般较嫩弱，分解养分能力差，要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应高，须选用易被菌丝吸收利用的物质，如葡萄糖、蔗糖、马铃薯、玉米粉、麦芽汁、酵母汁、蛋白胨、无机盐类及生长素等为原料。原种和栽培种所需数量较多，且菌丝分解养分能力强，可选用农作物的秸杆、粪草、锯木屑、麸皮、米糠等原料作为培养基。
(二)营养成分的配比
培养基中的碳、氮比例很重要。若培养基中碳源供应不足时，易引起菌种的过早衰老和自溶；若氮源过多或过少，则会引起菌丝过于旺盛生长或生长缓慢，对菌种培养不利。菌种培养基中的pH值也是影响菌丝生长的重要因素。一般培养基经高压灭菌后会使pH值有所下降，必须经检验后加以调整。调节pH值时，可用石灰澄清液，也可用氢氧化钠或盐酸。 在配制培养基时，为了避免沉淀物的生成而造成营养物的损失，应掌握加入各种营养物的顺序。一般应先加入缓冲化合物，溶解后加入主要元素，然后是微量元素，最后加入维生素等，最好是前一种营养成份溶解后再加入第二种营养成份。此外，培养基加入糖类时，应采用适当的灭菌方法，因葡萄糖在高压下易被破坏，多糖和双糖也因高温易被水解和变质。
二、培养基的类型
培养基的种类繁多，分类方法主要是按其成分、物理状态、用途等分类。
(一)根据营养物质来源分类
1.天然培养基 是用营养丰富的天然有机物配制而成。如木屑、稻草、麦粒、米糠、蔗渣、棉籽壳和动植物浸出液(土豆煎汁、麦芽汁、牛肉膏)等。都是配制天然培养基的原料。这些有机物来源广、价格低廉、使用方便，但其化学成分不恒定，即人们在使用时不能完全掌握它的化学成分，这类培养基只能用于生产，不适宜作精确的科学实验。
2.合成培养基 是用已知其化学成分的各类营养物质，定量地配制而成。适用于专门的营养生理等研究。生产上使用较少。
3.半合成培养基 是指在天然培养基中，添加一些已知成分的营养物质。在生产上应用较多。
(二)根据培养基质的物理性状分类
1.液体培养基 是将食用菌生长发育所需的营养物质，按一定比例配制的营养液。菌丝体在这种培养基中生长迅速，在短时间内可生出大量的菌丝体。这些菌丝体可作为各级种使用，充分缩短生长周期。但液体培养基的深层发酵工艺要求严格，成本投资大。另一方面是生产的菌种菌龄较难控制且易老化。
2.固体培养基 常见的固体培养基有两类：一是将液体培养基加入凝固剂(如琼脂)，制成常见的试管斜面或培养皿平板。这种培养基多用于菌种的分离、纯化或扩大保存。另一类是利用天然纤维物质或固形物，如木屑、秸杆、棉壳、废棉、土壤、畜粪等，加入适量的辅助营养料和水配制而成的培养基，生产上应用很广。
3.半固体培养基 这类培养基配制后呈软膏状，国外有部分应用，国内生产上很少用。
(三)根据用途分类
根据用途将培养基质分为母种培养基，原种培养基、栽培种培养基三种类型。
(四)根据表面形状分类
1.斜面培养基 将灭菌琼脂培养液注入试管，放置成斜面凝固而成。用于菌种扩大转管及菌种保藏。
2.平面培养基 将灭菌琼脂培养液倒入培养皿与三角烧瓶中凝固而成。用于菌种分离及研究菌类的某些特性。
3.高层培养基 将琼脂培养基注入试管内，灭菌，但不摆成斜面。这样接入菌种后虽然发育的面小了一点，但培养基的厚度增大，营养丰富，时间长些也不容易干燥、开裂。常用于保存菌种。

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三、培养基的配制
(一)母种培养基的配制
同一种菌类培养基的配方虽然有多种多样，但必须含有各种菌丝生长所需要的养分、水分和适宜的酸碱度。马铃薯、葡萄糖、琼脂作为各类母种的培养基最为普遍，菌丝都能正常生长。现将常用的培养基配方和配制方法举例介绍。
1.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)
马铃薯(去皮) 200g 葡萄糖 20g　　
琼脂 20g 水 1000mL
pH值 自然
2.马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA培养基)
马铃薯(去皮) 200g 蔗糖 20g　
琼脂 20g 水 1000mL
pH值 自然
以上两种培养基广泛应用于各种菇、耳、猴头类食用菌的培养。其具体制作方法是：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管中。
3.马铃薯半合成培养基(一)
马铃薯(去皮) 200g 葡萄糖 20g　
　 磷酸二氢钾 3g 硫酸镁 1.5g　
　 维生素B1 100mg 琼脂 20g　　
水 1000mL pH值 5.8～6.2
此配方制作方法与PDA培养基相同。不过加入部分化学药品，应在过滤后加入。适用于香菇菌种保藏用，也适于培养平菇、双孢蘑菇、滑菇、金针菇、灵芝和猴头等母种用。
4.马铃薯半合成培养基(二)
马铃薯(去皮) 200g 葡萄糖(蔗糖) 20g　
　 玉米粉 30g 黄豆粉 10g
酵母膏 2g 磷酸二氢钾 1.5g　　
硫酸镁 0.5g 琼脂 20g
水 1000ml pH值 自然
此配方适合各种菇类。制作时应注意：黄豆粉与马铃薯同时下锅，煮15分钟后再加入玉米粉，以免起糊影响过滤。
5.合成培养基(一)
蛋白胨 2g 葡萄糖 20g　　
磷酸氢二钾 1g 硝酸铵 1g
磷酸二氢钾 0.46g 硫酸镁 0.5g　
琼脂 20g 水 1000mL
6.合成培养基(二)
葡萄糖 10g 磷酸二氢钾 0.5g
氯化钠 0.2g 碳酸钙 2g
　　　琼脂 20g 水 1000mL
酵母汁(1：10) 100mL 硫酸镁 0.2g
将上述原料分别放入锅内，加水放入琼脂加热，并经搅拌熔化后即可分装试管。此配方适合双孢蘑菇、平菇、金针菇、滑菇等菌种培养。
7.蛋白胨葡萄糖培养基
蛋白胨 10g 葡萄糖 10g
　　 琼脂 20g 水 1000mL
　 pH值 5～5.5
将琼脂放入1000mL溶液中煮熔，再加入其他营养物后搅拌溶解，即可分装试管。主要用于竹荪母种培养。
8.葡萄糖蛋白胨培养基
葡萄糖 30g 蛋白胨 15g
　　 磷酸二氢钾 1g 硫酸镁 0.5g
琼脂 20g 水 1000mL
制作方法同上，主要用于茯苓母种培养。
9.苹果汁培养基
苹果 100g 蛋白胨 2g
　 蔗糖 20g 琼脂 20g
水 1000mL pH值 自然
将苹果洗净，切片，放入锅内加水1000mL，煮沸20分钟，过滤后取滤汁倒入锅内，补水至1000mL，然后加入琼脂熔化，加糖搅拌均匀即成。主要用于草菇母种培养。
10.棉籽壳汁培养基
新鲜棉籽壳 250g 葡萄糖 20g　　　
琼脂 20g 水 1000mL
取棉籽壳煮汁1000mL，加入其它营养成分即成。适合猴头、黑木耳等代料栽培的母种培养。
11.米粉培养基
大米粉 50g 葡萄糖 15g
　 蔗糖 15g 琼脂 20g
水 1000mL pH值 自然
12.玉米粉汁培养基
玉米粉 40g 蔗糖 10g
　　 琼脂 20g 水 1000ml
将玉米粉放入锅内，加水煮至70℃，保持60分钟，用纱布过滤，取滤汁1000mL放入锅内，先后加入琼脂和糖溶解即成。主要适用于木耳、香菇、双孢蘑菇和金针菇等母种培养。
13.马铃薯淀粉培养基
马铃薯淀粉 40g 葡萄糖 10g
　　蛋白胨 5g 磷酸二氢钾 0.5g
氯化钠 5g 琼脂 20g　　
水 1000ml
将淀粉用凉水化开，加热煮沸，再加琼脂与蛋白胨熔化后，其它成分加入搅拌即成。适于银耳芽孢萌发，又适于银耳纯菌丝培养。
14.豆芽汁培养基。
黄豆芽 200g 葡萄糖 20g
　　琼脂 20g 水 1000mL
　　 pH值 自然
将黄豆芽洗净放入1000mL水中煮20分钟，过滤取汁，补至1000mL，加入琼脂煮熔，葡萄糖放入锅内搅拌均匀即成。主要适用黑木耳，猴头、平菇等菌种培养。在缺乏马铃薯的季节，可代替PDA培养基。
15.胡萝卜琼脂培养基
胡萝卜 100g 琼脂 18g～22g　
　 水 1000mL pH值 自然
胡萝卜切条加水文火煮沸20分钟后滤汁，熔化琼脂即成。适用于培养真菌，菌丝生长优于PDA培养基。
16.葡萄糖蛋白胨奶粉培养基
葡萄糖 40g 蛋白胨 10g
　 　全脂奶粉 5g 蒸馏水 1000mL
　 pH 6.8
适合于培养冬虫夏草菌。
将上述培养基配制好后，趁热倒入大的搪瓷漏斗中，打开弹簧夹，让培养基液顺橡皮管流入试管内。装入量为试管总长的l/50装好后，随即关闭弹簧夹。然后将分装的试管，再塞上大小均匀，松紧适中的棉塞。棉塞总长约4cm～5cm，一般要求3/5留在管内，其余2/5露在管外(图4—7)。最后把塞好棉塞的试管，每7～10支扎成一把，用牛皮纸包住皮筋扎紧，放入手提式高压灭菌锅内，1.5kg／cm2灭菌20分钟，冷却达70℃左右从锅内取出，趁热摆好斜面，一般斜面长度达试管全长的1/2为宜。
最后，把斜面培养基放在30℃的条件下，空白培养1～2天，检查确无污染杂菌，便可使用。

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(二)原种和栽培种培养基的配制
原种和栽培种的营养条件基本相似，制作方法也相同，故一并加以介绍。食用菌的原种及栽培种培养基，一般腐生菌(蘑菇、草菇)用粪、草原料配制；木腐菌(香菇、平菇、黑木耳、银耳、灵芝、猴头、茯苓等)都可用木屑、米糠、种木或棉壳作为菌种的培养基。培养基的配方繁多，现主要介绍如下：
1.粪草培养基 是以畜粪和稻草为主料的培养基，主要的配方有以下几种：
配方(一) 干稻草 80% 麸皮 19%
石膏粉 1%
将干稻草切成2cm～3cm长，浸水1—2天，使其吸足水分后捞起沥至不滴水，加入辅料拌匀，含水量在65%左右。此培养基适于培养草菇、平菇和风尾菇等菌种。
配方(二) 粪草(经发酵) 90% 糖 l%
麸皮或米糠 8% 碳酸钙 1%
将干牛粪与稻草(麦草)以6：4之比，按蘑菇堆肥制作工艺进行堆积发酵15～20天，在这过程中要翻堆2～3次，然后挑出半腐熟的稻草，切成2cm～3cm长，晒干即为粪草备用。
制培养基时，按比例取粪草与其他辅料混匀，用糖水拌料，含水量约60%。此培养基适于制作蘑菇菌种。
配方(三) 干稻草 63% 玉米粉 4%
过磷酸钙 3% 牛粪 25%
大豆粉 3% 硫酸镁 2%
将稻草切成约3cra长，浸透水后捞起，沥至不滴水，不经发酵直接加辅料拌匀，含水量约60%。此培养基适于制作蘑菇、草菇等菌种。
配方(四) 厩肥 42% 废棉 42%
碎稻草 11% 米糠 2%
石灰 3%
先将厩肥、废棉、碎稻草浸湿，再与米糠、石灰拌匀，堆积发酵约20天，这期间翻堆3～4次，含水量为65%。此配方适于制作草菇菌种。
2.木屑培养基 以木屑为主料的培养基配方很多，现举例如下：
(1)阔叶树木屑 78% 麸皮或米糠 20%
蔗糖 1% 石膏粉 1%
适于制作香菇、平菇类、黑木耳、金针菇、滑菇、灵芝、猴头菇等木腐型菌种。
(2)阔叶树木屑 77% 麸皮 20%
蔗糖 1.5% 石膏粉 l%
尿素 0.5%
适于制作平菇、凤尾菇和金针菇等菌种。
(3)阔叶树木屑 98% 麸皮 1%
尿素 0.4% 碳酸钙 0.3%
磷酸二氢钾 0.2% 硫酸镁 0.05%
高锰酸钾 0.05%
适于制作香菇、侧耳类等菌种。
(4）阔叶树木屑 75% 麸皮 22%
蔗糖 1.5% 石膏粉 1.4%
维生素B1 0.1%
适于制作金针菇、猴头菇等菌种。
(5)阔叶树木屑 66% 麸皮或米糠 30%
蔗糖 1% 石膏粉 1%
黄豆粉 1.5% 硫酸镁 0.5%
适于制作银耳菌种。
(6)杂木屑 73% 麸皮 25 %
蔗糖 1% 磷酸二氢钾 0.1%
硫酸镁 0.1% 碳酸钙 0.8%
适于制作竹荪菌种。
(7)阔叶树木屑 75% 麸皮 24%
蔗糖 0.8% 硫酸铵 0.2%
适于制作灵芝菌种。
(8)松木屑 77% 麸皮或米糠 20%
蔗糖 2% 石膏粉 1%
适于制作茯苓菌种。
以上八例培养基的制作方法是：按配方称取原料，先将糖溶解于适量水中，其他原料进行混合，然后加入糖水拌匀，使料含水量达60%～65%(每千克料加水120kg～130kg)。简便检查含水量的方法，是用手取一把培养料紧握，以指缝间有水纹但不滴下为适度。
3.棉籽壳、蔗渣培养基 以棉籽壳和蔗渣为主料的培养基配方常用的有以下几种：
(1)棉籽壳 78% 麸皮 20%
蔗糖 1% 石膏粉 l%
这是一种应用较广泛的培养基，特别适于制作金针菇、平菇、凤尾菇、草菇、银耳、黑木耳、猴头菇等菌种。
(2)棉籽壳 96% 蔗糖 2%
过磷酸钙 1% 石膏粉 l%
适于制作金针菇、平菇、凤尾菇、草菇、木耳、猴头菇等菌种。
(3)甘蔗渣 75% 麸皮或米糠 24%
石膏粉或碳酸钙 1%
适于制作平菇、凤尾菇、金针菇、毛木耳等菌种。
(4)甘蔗渣 87.5% 麸皮 10%
碳酸钙 1% 蔗糖 1%
尿素 0.5%
适于制作黑木耳栽培种。
(5)棉籽壳 78% 麸皮 15%
玉米粉 5% 蔗糖 1%
石膏粉 1%
适合制作金针菇菌种。
(6)甘蔗渣 80% 竹叶粉 18%
蔗糖 1% 石膏粉 1%
适合制作竹荪菌种。
以上六例培养基的制作方法是：按配方称取主料和辅料，先将棉籽壳或蔗渣加适量水 拌匀，堆闷3～4小时或一夜，使之均匀吸水，然后参照木屑培养基的制作方法进行操作。

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4.玉米芯、花生壳培养基 以玉米芯和花生壳为主料的培养基，是近年来发展起来的一类配方。
(1)玉米芯 78% 麸皮或米糠 20%
石膏粉 1% 蔗糖 1%
适于制作草菇、平菇、木耳、猴头菇等木腐菌菌种。
(2)玉米芯 80% 米糠 10%
玉米粉 8% 石膏粉 1%
复合肥1%(制原种改用0.2%磷酸二氢钾)
适于制作平菇等菌种。
(3)花生壳 40% 玉米芯 38%
麸皮 20% 蔗糖 1%
石膏粉 1%
适于制金针菇菌种。
(4)花生壳 78% 米糠 20%
石膏粉 1% 蔗糖 1%
适于制作平菇、香菇、木耳、猴头菇、灵芝等木腐菌菌种。
以上四例配方的制作方法是：把玉米芯和花生壳都先经碾碎处理，然后将玉米芯、花生壳置pHl0～11的石灰水中浸泡一夜，捞出沥至不滴水后，再按木屑培养基的制作方法拌入辅料和调控含水量。
5.谷粒培养基 以小麦、大麦、高梁、小米、玉米等为主料制作的培养基，均称为谷粒培养基，其配方举例如下：
(1)小麦或燕麦 98% 碳酸钙 2%
碳酸钙或石膏粉 2%
适合于多数菌种。（除银耳外）
(2)小麦 93% 碳酸钙或石膏粉 2%
木屑 5%
适合于制作蘑菇、平菇等菌种。
(3)稻谷 50% 棉籽壳 40%
麸皮 8% 石膏粉 2%
适合于制作平菇、凤尾菇等菌种。
(4)玉米粉 70% 阔叶树木屑 25%
麸皮 4% 石膏粉 1%
适合于制作黑木耳菌种。
谷粒培养基的制作方法分别是：
(1)麦粒培养基 常规制作方法是首先将小麦过筛，出去杂物，再放入清水浸泡，使其吸足水分，浸水时间因气温而异，—般4～5月份浸24小时，6～9月份浸16小时，至麦粒露白发芽；捞出并用清水冲洗数次，沥干后置沸水锅中煮沸3～5分钟捞出，此时麦芽膨大而无破裂。入清水冷至常温，沥去多余水分，即可与碳酸钙等辅料拌匀，装瓶(袋)、灭菌。
(2)稻谷培养基 选颗粒饱满的稻谷，先在冷水中浸泡2～3小时，再置沸水中煮20～30分钟，见大部分谷粒稍有开裂时(不可煮糊)起锅，汤干后拌入辅料即可装瓶(袋)。
(3)玉米粒培养基 先将玉米粒置0.2%多菌灵水溶液中浸约45小时，捞起冲洗后再煮20～30分钟，玉米粒以熟而不烂为宜。把经煮熟的玉米粒起锅后铺在筛上，沥去多余水分，即可装瓶、灭菌。
6.种木培养基 是以阔叶树木或毛竹为主料配以辅料制成的培养基。常用的配方是：
种木(木块、三角木、枝条) 35kg 木屑 9kg
米糠(或麸皮) 5kg 蔗糖 0.25kg
石膏粉 0.25kg
制作木块菌种时，可先将种木锯成木条，再用刀切成楔形木块，或将种木横锯成1.2cm～1. 5cm厚的木片，用直径lcm的皮带冲从圆片上冲下一个直径lcm、长1.2cm～1.5cm的棒形木块、风干后备用。制作茯苓木块菌种时，应选用长10cm～12cm、宽2cm～4cm、厚0.5cm～lcm的松木块。制作枝条菌种常采用桑、梨、悬铃木、小栗树等枝条，这些树木枝条多，易收集，利用率高；用枝剪将枝条剪成长约1.5cm的圆形小段即可风干备用。
配制时先将准备好的种木浸入蔗糖或淘米水中24小时，使其充分吸足水后捞出过滤。同时将木屑、米糠等原种拌和，调节含水量达60%左右，然后取出三分之二与种木拌和均匀即可装瓶。而另三分之一可留下，覆在种木培养基的上方，以填补种木间的空隙。

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(三)原种、栽培种培养基的分装
装瓶(袋)前必须把空瓶洗刷干净，并倒尽瓶内渍水，然后一边装，一边用木棒压紧，直至瓶肩为止。装好瓶后，要用圆锥形木棒在瓶中打一个洞，直到瓶底和临近瓶底为止，以增加瓶内透气，有利菌丝沿洞穴向下蔓延，也利于菌种块的固定。有条件的地方可采用简易打洞机打洞，以提高打洞速度和质量，减轻劳动强度。洞眼打好后，随即用清水把瓶身和颈口洗抹干净，待瓶口晾干后即塞上棉塞，如再在瓶口用防潮纸或牛皮纸包扎，对防杂的效果更好。棉塞要求干燥，松紧和长度合适，成包子形，总长4cm～5cm，三分之二在瓶口内，三分之一露在口外，内不触料，外不开花，用手提棉塞瓶身不下掉。这样透气好，种块也不会直接接触棉塞受潮感染。
粪草培养基装瓶的质量要求上紧下松，内松外紧，前期种宜紧，后期种稍松。紧不可有层叠印，松不能有蜂窝眼，瓶口定要扎紧抹净，一般750mL菌种瓶装好料连瓶重0.85kg左右。
麦粒菌种培养基只要将麦粒装至瓶肩，将瓶身稍震动几下，然后用干布将瓶口内壁擦抹干净，不必再行打洞。在装麦粒培养基时，可在瓶口内的上部用少量的料草衬口，以免搬动和倾斜时麦粒松散。
种木培养基装瓶时，应余下三分之一的木屑配料盖在表面，然后压紧压平，有利菌丝封口和菌丝的茁壮生长。
目前菌种容器采用玻璃瓶装的较普遍，但玻璃瓶在操作过程中易破碎，损失大，成本也高。如果生产栽培种时，采用聚丙烯塑料袋或农用的聚乙烯塑料薄膜袋较为适用，而且经济。特别是香菇、木耳等压块用种，效果最佳，可节省大量的挖瓶人工，且菌丝受损伤少，有利于子实体的生长。
用塑料袋生产菌种，袋长40cm、宽15cm左右。高压灭菌的用聚丙烯，常压灭菌用聚乙烯薄膜比较经济。装料可用装袋机，上下松紧一致。两头袋口套塑料环，用报纸二层上盖塑料封口，然后用橡皮筋扎紧，经灭菌后接种。
四、培养基灭菌
培养基装管装瓶(袋)后，应立即进行消毒灭菌，如灭菌不彻底，就容易产生杂菌，给生产造成损失。
(一)母种培养基灭菌法
母种培养基灭菌一般用手提式高压锅。灭菌时将试管7～10支扎成一捆，再用防潮纸或牛皮纸包住试管棉塞，管口朝上，防止灭菌时棉塞潮湿。高压灭菌的时间，在1.2kg～1.5kg/cm2压力下保持15～20分钟即可。但在使用高压锅灭菌时还应注意如下事项：
1.灭菌时锅中水要放至水线为止。如放水过少易引起烧干及烧焦培养基；如放水过多，棉塞易潮湿，以后易感染杂菌。
2.锅内的冷空气必须排除干净，否则达不到灭菌的温度。排除锅内冷空气的方法有两种，一是将灭菌锅升火后，从开始出气起，经5分钟左右的排气，至从排气阀出的气达到直喷时，再关闭排气阀；另外一种是将排气阀关闭升火，待压力升到0.5kg/cm2时，打开排气阀，使指针降落到“0”后，再关闭气阀，烧至所需压力。
3.灭菌时间不易过长或过短，过长养分易被破坏，培养基颜色发黄，对菌丝生长不利；过短则达不到灭菌的效果。灭菌结束后，放气速度不能太快，宜逐渐进行，使指针慢慢下降到“0”，才揭开锅盖，否则棉塞容易冲出试管。
在没有高压锅的条件下，可以用土蒸汽锅灭菌，但要相应延长灭菌时间，在100℃下的温度应保持4～6小时。为了灭菌彻底，可采用间歇灭菌法，每天水烧开后蒸煮1小时(100℃)，连续三天。
培养基灭菌结束后，应立即取出试管直立放置2～3分钟，待试管壁上的水珠回到培养基内后，再趁热搁置斜面。这样，试管壁上不会有大量的水珠，温度适当。斜放时，一般使斜面为试管总长的二分之一至三分之一。放好后，再用纱布覆盖，防止冷却过程中因温度急剧变化而使管壁形成水珠。
经灭菌后的斜面试管，必须在接种前于每一批或每锅中取出3～4支，放在28℃～30℃的恒温箱中培养2～3天作空白试验。经培养后，斜面仍光洁透明，无杂菌或细菌出现，则表示灭菌彻底，可作接种用。如发现杂菌，则应找出原因，并将这批试管重新灭菌一次后方可使用。
(二)原种、栽培种的高温灭菌
原种、栽培种所需的数量多，灭菌一般采用较大的灭菌锅。采用高压蒸汽锅进行湿热灭菌时，升温火力应逐渐加大，以防锅内温差变化太大，引起玻璃瓶炸裂破损。当压力开始升到0.5kg/cm2时，即打开排气阀排出冷气，待冷空气放尽后，再关上排气阀重新升温，烧至所需压力。
高压灭菌所需要的时间，应根据培养基原料的种类和生熟程度来决定长短。木屑、棉壳、蔗渣和种木为主料的培养基灭菌时的蒸汽压力要求达到1.5kg/cm2，保持60分钟；稻草培养基和粪草培养基，在同上的压力下，保持90分钟；而麦粒培养基则要保持120分钟，才能达到灭菌效果。
采用土锅灭菌时，在98℃～100℃的温度下，需连续灭菌6～8小时；麦粒培养基的灭菌时间须达12小时为宜。停火后再焖蒸3～4小时才能出瓶(袋)。
采用塑料薄膜袋装菌种培养基灭菌时，可按以上方法进行灭菌。聚乙烯耐压，耐温性能差，故只能采用常压灭菌，100℃保持8～12小时。聚丙烯塑料薄膜耐温、耐压性能好，可在1.5kg/cm2压力下保持2小时，灭菌彻底且不会破裂。灭菌后不要立即打开锅盖，待温度下降至50℃时趁热开锅取出，这样可减少每包粘连一起的现象。
培养基灭菌完毕从锅中取出后，应放于清洁、凉爽、干燥的室内进行冷却待接，并在棉塞上喷5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液，以防杂菌感染。

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菌种分离与培养
人们采取无菌操作的方法，把某种食用菌从混杂的微生物中，单独地分离开来，这个过程叫做菌种分离。从分离过程中得到的菌丝体纯化后，就是纯菌种。在实验室条件下，以人工使纯菌种大量生长和繁殖的方法，叫做培养。
一、母种培养
(一)菌种分离
菌种分离通常采用的方法有孢子分离法、组织分离法和寄主分离三种方法，三种方法各有特点，可根据不同的菌类和生产条件选择使用。
1.孢子分离法 孢子分离法，是利用成熟子实体的有性孢子能自动从子实体层中弹射出来的特性，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，而获得纯种的一种方法。
(1)孢子的采集
①种菇的选择 用作分离菌种的种菇，应选择出菇早、朵型好、个体肥大、生长健壮、无病虫害、八成熟的菇体。一进入出菇期，就要注意观察选择，并作好标记。不同的食用菌选择的具体要求是：
香菇 菇型圆整，菇体肥大，柄细而短，菌盖呈深褐色，出菇早，无病虫害，一般为八成熟的子实体。
双孢蘑菇 菇型圆整，光滑直立，颜色洁白，柄粗盖厚，无病虫害，生长快而健壮的单生菇。
草菇 菇型端正，肥大健壮，包被未破，无病虫害的单生菇。
平菇 出菇早，菌盖厚实，重叠丛生，菌柄粗短，色泽鲜亮，尚未散发孢子，八成熟而无病虫害的子实体。
木耳 选朵大、耳片厚、色黑、生长健壮、褶皱多、无病虫害的春耳。
银耳 朵大肉肥、色泽洁白、展片良好、朵型美观、八成熟、无病虫害的子实体。
猴头 形状正常、颜色洁白、出菇早、生长健壮、菌刺丰满、无病虫害的子实体。
金针菇 出菇早而均匀、生长健壮、朵型正常、菌柄长短适中、无病虫害的子实体。
②种菇的消毒 子实体采回后要及时切除基部，并进行表面消毒。对子实体层未外露的种菇(如蘑菇等)，可浸入0.1%升汞溶液中消毒约1分钟，用镊子捏出后经无菌水冲洗数次，再用无菌纱布将表面水吸干；对于子实层裸露的种菇(如香菇等)，只能用75%酒精揩擦菌盖及菌柄表面；而对于银耳、木耳类子实体，却千万不能接触消毒剂，只能置于烧杯中用无菌水洗涤，然后捏起再经无菌水冲洗数次，同样用无菌纱布吸干表面水。
种菇(耳)经消毒处理后即可采集孢子。在采集前，事先要备好孢子收集器和接种箱，将孢子采集器放入消毒锅内以1.5kg/cm2的压力灭菌1小时，然后取出放入已消毒的接种箱内备用。
③采集孢子的方法 根据具体情况，采用下列方法进行孢子采集。
整菇插种法：适用于伞菌类的孢子采集。在接种室(箱)中，将经消毒处理的整只种菇插入无菌孢子收集器里，再将孢子收集器置适温下让其自然弹射孢子(图4—8)。待孢子下落后，将孢子收集器移至无菌室(箱)中，打开钟罩，拿去种菇和支架，将培养皿盖好，并用透明胶纸或胶布封贴保存。
三角瓶钩悬法：适用于不具菌柄的子实体
(如木耳、银耳等)孢子的采集。即在无菌室(箱内)，将耳片用无菌水洗涤，无菌纱布吸干，取一个事先准备好的金属两头钩，经火焰灭菌后一端钩住耳片，另一端钩在三角瓶口上(瓶内装有1cm厚经灭菌的PDA培养基)，加棉塞(图4—9)，置室温下培养1～2天，见培养基表面有一层白色孢子印时，即可移入无菌室(箱)里，取出钩子和耳片，仍塞好棉塞保存备用。
菌褶涂抹法：在接种室(箱)内，取消毒好的菌盖，用经火焰灭菌的接种环，沾上无菌水后准确地直插在两片菌褶之间(切勿使接种环接触到裸露于空气间的菌褶部分，以免粘上杂菌)。轻轻地抹取子实层，将尚未弹射的孢子沾在接种环上，取出接种环，在准备好的斜面培养基上或平板培养基上划线接种，加棉花塞或盖上平皿。此法在野外采种时尤为方便，但仍要无菌操作，且动作要准确、敏捷。
空中孢子捕捉法：凤尾菇、平菇、香菇等伞菌子实体成熟后，大量的孢子会自动弹射出来，在子实体周围用肉眼可见烟雾状的“孢子云”，此时迅速将事先制备好的培养基平板或试管口面迎“孢子云”方向，使孢子附着在培养基表面，随即盖上皿盖或加棉塞即可。

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(2)孢子的分离
①单孢分离法 是将采集到的孢子单个分开进行培养，让它单独萌发成菌丝而获得纯种的方法。在目前已驯化栽培的食用菌中，蘑菇和草菇等同宗结合型的食用菌，由单孢子培养的菌丝，经双核化后形成的双核菌丝体，一般都具有结实能力，因此可以采用单孢分离法来生产纯菌种。其他的一些食用菌类，如香菇、平菇、金针菇、凤尾菇、毛木耳等异宗结合型食用菌，其孢子具有性别，单个孢子萌发的菌丝无结实能力，必须通过不同性别的单孢子间的结合，才能结实。因此，单孢分离法直接在生产上应用不多，但它却是研究食用菌生物学特性和遗传育种的一项重要技术。
单孢分离技术包括稀释分离法、平板划线分离法、器械分离法和毛细管法。现主要介绍稀释分离法，其具体操作过程如下：
制备无菌水试管 取5支试管，其中1支装10mL蒸馏水，4支各装9mL蒸馏水，经高压灭菌即成无菌水。
制孢子悬浮液 取一接种勺孢子粉，置于10mL无菌水试管中，摇振使孢子分散成悬浮液；用无菌注射器或1lmL的吸管，吸取1mL孢子悬浮液于第2支试管中，摇振使其分散；再从第2支试管中吸取1mL注入第3支试管……如此直至稀释到第5支试管，并取第5支试管稀释液在显微镜下检查，如果孢子是单个的，说明已达稀释目的，否则还须继续稀释。 制培养基平板将琼脂培养基融化至60℃，倒入平皿(直径9cm的培养皿注入15mL即可)，待冷却至45℃左右时，另取2支无菌注射器或吸管，从第4，5支试管中各吸取孢子液0.2mL，分别注入平皿中(每种浓度各接3～4个平板)，与培养基充分摇匀，待凝固后倒置于25℃恒温箱中培养。
挑单个菌落培养纯种 在培养期间，每天要取出观察，严格挑选发育匀称、生长快速的单个菌落，移入新斜面培养基上进行培养即为纯种；如系异宗结合的菌类，则要同时挑选能生育的一对单菌落。
②多孢分离法 就是把许多孢子接种在同一培养基上，让其萌发，自由交配，从而获得纯种的方法。此法简便易行，在食用菌制种中应用较为普遍。常用的方法有以下几种：
直接培养法 将采集到孢子的接收器(装有琼脂培养基的试管或平皿)，直接置恒温箱中培养，待孢子萌发后挑选特征典型的菌落，再转接培养成母种。
斜面划线法 按无菌操作规程，用无菌接种针沾取少量孢子，在PDA试管斜面培养基上自下而上划线，划线时勿用力，以免划破培养基表面。接种完毕，抽出接种环，灼烧管口，塞上棉塞。按照各菌种的菌丝生长温度要求，置恒温下培养。待孢子萌发后，挑选萌发早，长势旺的菌落，转接于新试管培养基上再行培养即成母种。
涂布分离法 用接种环挑取少许孢子至装有无菌水的试管中，充分摇匀制成孢子悬浮液，然后用经灭菌的注射器滴管，吸取孢子悬浮液，滴1～2滴于试管斜面或平板培养基上，转动试管使孢子悬浮液均匀分布于斜面上，或用玻璃利刀将平板上的悬浮液涂布均匀。孢子经恒温培养萌发后，挑选几株发育匀称、生长快速的菌落，移接于另一试管斜面培养基上，恒温培养即成母种。
以上几种多孢分离培养的方法，仅从菌丝生长情况、菌落形态等外部特征进行鉴别，还不能作为菌种优劣最后的根据。为了保证母种的质量，还需要作生物学鉴定，即进行出菇试验，根据其生物学特性和生物学效应等数据，才能确定是否能应用于生产。

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2.组织分离法 是利用子实体组织来分离获得纯菌丝的方法。食用菌的子实体实际上是菌丝体的扭结物，具有很强的再生能力，通过菇体组织分离，培养纯种，此种方法简便，取材广泛，不易发生变异，又能保持种性，无论幼菇或成熟菇体，只要是新鲜的，均能分离培养。
(1)香菇、平菇组织分离法 香菇、平菇组织分离时，首先应从出菇早、结菇均匀、生长旺盛的菇木上或菌砖上，挑选发育正常，菇蕾长出不久，边缘尚内卷，菇柄短壮，菇盖肥厚，无病虫害的种菇作分离材料。
分离时，将采好的种菇用清水洗净表面，然后带入无菌室(箱)内，放入0.2%升汞水或75%的酒精内浸泡分钟，取出用无菌水冲洗1～2次，用无菌纱布吸干水渍，放入清洁的培养皿内，用消毒过的小刀把菇蕾纵剖为二，在菇盖与菇柄相接处的部分切取绿豆大小 菌肉（图4-10），移接在斜面培养基中央。
试管接种后放入25℃～27℃恒温下培养2～3天，组织块上就长出白色的菌丝，15天后，菌丝就可以长满培养基斜面。再移接到新的培养基上培育成母种。
（2）黑木耳的组织分离法 由于黑木耳的耳瓣薄，并富有胶质，所以在过去的分离法中很少采用耳片组织分离。其实采取组织分离法，操作容易，方法简便，只要消毒操作严格，分离极易成功。在自然气温下干燥的，贮放期在6个月内的干种耳，分离后均能长出菌丝体。
具体操作：先将干耳浸水6～8小时，然后用冷开水冲洗2～3次，再用清洁纱布或药棉吸干渍水，带入接种箱内，在无菌水中摇动4～5分钟，取出用75%酒精擦洗表面，用无菌水冲洗多次，再将耳片用无菌剪刀将四周边缘去掉，切取0.lcm左右的组织块，接种在试管中部培养基边壁上，以利长出菌丝，接种后放入28℃～300℃的恒温下培养1～2天后，就可看到白色绒毛状菌丝，初期生长较慢，5～6天后生长迅速，1.5天左右就可长满全管。
(3)其它菌类组织分离法 草菇、猴头、灵芝、茯苓等组织分离法操作程序和消毒方法与香菇组织分离相似，培养温度因种类不同各有差异。
草菇选择外形端正、健壮肥大、包皮未破的菌蛋作分离材料，取菌柄与菌伞连接处的组织，接到试管培养基后，放在30℃～33℃温度下培养。
猴头组织分离法首先应选肥大、幼嫩、刺短，生长健壮的子实体，然后用清水洗净表面，将外表菌刺削去后按香菇组织分离操作进行消毒，用无菌解剖刀在子实体上划一条缝用手沿缝掰开，挑起心部小块组织移入斜面培养基中，置于20℃～22℃温度下培养。灵芝的组织分离也是取菌柄与菌盖连接处的小块组织，接种后的培养温度在25℃左右。
茯苓是采用菌核分离，首先应选择个体大而结实，生长旺盛，表面可见裂纹，颜色为紫红褐色，皮薄，肉色白，掰开后可见细小的乳白色或绿豆浆色的浆液，重达1.5kg以上的鲜菌核作为分离材料，所取组织块相对要大点。试管接好后,置于22℃的恒温下培养。为了防止菌种退化。最好各品种每年用组织分离重新分离一次，以确保菌种质量的优良。
3.寄主分离法 寄主分离法是从生长有菇耳的木材中获得纯种的一种方法，也叫种木分离法。常用于黑木耳和银耳的菌种分离。
(1)黑木耳的寄主分离法 黑木耳的耳木分离应在盛产子实体的季节进行。选择经自然孢子繁殖的，结耳多、耳片大、无杂菌和病虫害的耳棒；或选择人工接种在1～2年内出耳，出耳旺盛，朵形大的耳棒做分离材料。
分离前，先把耳木晾干，然后在黑木耳生长最好的部分，锯取约2cm厚的小段，去掉树皮，放入0.1%升汞水溶液或75%酒精内浸泡约1分钟，取出用无菌水冲洗2～3次，再用无菌纱布吸干，放入垫了无菌纱布并已消过毒的小木板上，用灭过菌的利刀把木块四壁劈去，再将种木切成半根火柴杆大的小条，截去两头，移接于斜面培养基上，置于22℃～25℃下培养2～3天，种木条上就可长出白色菌丝，再培养15天左右，菌丝就可长满斜面。再从中挑选菌丝粗壮、生长势强、无杂菌、木耳菌丝特征明显的试管作栽培试验，从中选出表现最好的作为母种繁殖之用。
(2)银耳的寄主分离法 银耳的耳木分离法和黑木耳的耳木分离法基本相同。但更应注意，切取长耳的中间部位，不取耳木两端。因为两端裸露在外，污染率高。将接好种的试管放入23℃～25℃下培养，经2～3天后，在种木块上就会长出白色纤细的菌丝，并延伸到培养基上，约5天后培养基颜色变黄，随着培养时间的延长，培养基的颜色逐渐加深至黑色，并在培养基表面出现浅灰色斑纹的香灰菌丝。经7～10天后种木上出现白色短绒状菌丝，同时分泌白色或淡黄色水珠的银耳发育菌丝。然后选取有发育菌丝的试管，分离扩大，进行瓶栽或段木栽培试验。
其他菌类如香菇、平菇、猴头、灵芝、茯苓等，在没有采摘到子实体的情况下，才采用寄主分离法获得母种。