[推荐]食用菌制种技术

蘑菇人

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食用菌制种技术

特种技术前言
制种设备
消毒灭菌
菌种培养基
分离培养
菌种保藏
制种方法

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食用菌制种前言
食用菌生产所用的菌种，是提供繁殖而分级制作的菌丝体培养物，相当于高等植物的种子。在自然界中，食用菌繁衍后代依靠孢子，孢子在适宜的环境下，萌发成菌丝体。菌丝体生长繁衍达到生理成熟后，在适宜的环境下，就可形成子实体。在人工栽培食用菌时，孢子虽然是它的种子，但人们至今都不用孢子直接播种，而是用孢子或子实体组织萌发而成的纯菌丝体作为播种材料。因此，通常所指的菌种，实际上是经过人工培养并进一步繁殖的食用菌的纯菌丝体。
制种是食用菌生产最重要的环节。常言道：“有收无收在于种，收多收少在于管”，可见菌种在生产中的重要性。在食用菌生产过程中，菌种好坏，直接影响食用菌的产量和质量。因此，培育优良菌种，是提高食用菌生产水平的重要环节。人工培养的菌种，根据菌种培养的不同阶段，可分为母种、原种和栽培种三类。一般把从自然界中，首次通过孢子分离或组织分离而得到的纯菌丝体称为母种，或称一级种。它是菌种类型的原始种。原始母种通过移接(转管)成数支试管(斜面)种，这些移接的试管种，亦可称为母种。把母种移接到木屑、谷粒、棉籽壳、粪草等瓶(袋)培养基上培养而成的菌种称为原种，或称二级种。它是母种和栽培种之间的过渡种。把原种扩接到相同或类似的材料上，进行培养直接用于生产的菌种称栽培种，或称三级种。制作菌种的具体操作工艺流程见图4—1。
原种和栽培种，均能直接用于生产。栽培种不能再扩大繁殖栽培种(银耳菌种例外)，否则会导致生活能力下降。
分离
↓
　　　　母种培养基制备→高压灭菌→接种→筛选提纯→原始种→中试后确定母种
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　↓
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　————— 转管扩接←保贮
↓
原种培养基制备→高压或常压灭菌→接种→培养→原种
∣
——————
↓
栽培种培养基制备→常压或高压灭菌→接种→培养→栽培种

图4-1　制种工艺流程图

食用菌的菌种生产，基本上是按菌种分离→母种扩大培养→原种培养→栽培种培养的程序进行。菌种通过三级扩大，菌种数量大为增加，同时菌丝也从初生菌丝发育到次生菌丝，使菌丝更加粗状，分解基质的能力也增强。只有采用这样质量的菌种，才能获得优质高产的子实体。

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制作菌种的基本设备
一、配料室设备
不同的生产规模，配料所需要的设备有所不同，但配料应在有水、有电的室内进行，其主要设备有以下几类：
(一)衡量器具
配料室一般应配备磅秤，手秤，粗天平，量杯，量筒等，以供称(量)取用量较大的培养料、药品和拌料用水等。
(二)拌料机具
拌料必备的用具有铁铲，铝锅，电炉或煤炉，水桶，专用扫帚和簸箕等。具有一定规模的菌种厂，还应具备一些机械设备，如枝丫切片机，木片粉碎机，桔杆粉碎机和拌料机等。
(三)装料机具
采用手工装料，无需特殊设备，只要备一块垫瓶(袋)底的木板和一根丁字形捣木(供压料时用)。但具有一定规模的菌种厂，为了提高装料效率，应购置装料机。装料时，以玻璃瓶作容器的要压料和打接种穴，可用瓶料专用打穴器。以塑料袋作容器，制银耳和香菇栽培种，一般装料后随即要在袋壁打接种穴，可用塑料袋专用打穴器。
二、灭菌设备
灭菌设备，一般是指用于培养基和其他物品消毒灭菌的蒸汽灭菌锅。灭菌锅是制种工序中必不可少的设备。灭菌锅消毒的原理，是利用水吸收一定的热量之后而成为饱和蒸汽，当蒸汽冷凝时就会释放出一定的热量。在消毒灭菌时，饱和蒸汽在一定的温度和压力下拥有大量的热量，遇到冷的消毒物体时，冷凝而改变状态随之就释放出大量的热量。使被消毒物体受热、受潮，在热和湿的作用下，可在较短时间内能有效地将顽抗性的细菌芽孢以及其他杂菌杀死，达到消毒的目的。
(一)高压蒸汽灭菌锅
高压蒸汽灭菌锅是一个密闭的，能承受压力的金属锅，在锅底或夹层中盛水，锅内的水煮沸后产生蒸汽。由于蒸汽不能向外扩散，迫使锅内的压力升高，即水的沸点也随之升高，因此可获得高于100℃的蒸汽温度，从而达到迅速彻底灭菌的目的。高压蒸汽灭菌锅有以下几种类型：
1.手提式高压灭菌锅 此种灭菌锅的容量较小，主要用于母种斜面培养基、无菌水等灭菌用，可用煤气炉、木炭或电炉作热源。较轻便、经济。
2.立式和卧式高压灭菌锅(柜) 这两类高压锅(柜)的容量都比较大，每次可容纳750ml的菌种瓶几十至几百瓶，主要适用于原种和栽培种培养基的灭菌，用电热作热源。
3.自制简易高压锅 菌种生产量较大的菌种厂可自制简易高压锅。采用10mm厚的钢板焊接成内径为110cmx230cm的筒状锅体，底和盖用15m厚的钢板冲成半圆形，否则平盖灭菌时棉塞易潮湿。锅口用紧固的螺丝拧紧密封，锅上安装压力表、温度计、安全阀、放气阀、水位计、进出水管等设备。以煤作燃料，用鼓风机助燃升温。菌种袋(瓶)放入铁提篮内，吊入锅中，一般约放4～5层，每锅装800～1000袋(瓶)，适合于专业菌种厂制作栽培种培养基的灭菌。
(二)土法灭菌锅
土法灭菌锅有多种多样的类型，一般分为土法蒸锅和蒸笼等形式。
1.土蒸锅 用砖砌成灶，灶上用砖和水泥砌成桶状或方形蒸汽室，底部为大铁锅。可从侧面开门，也可以从顶盖进出。门上附有放温度计的小孔，铁锅上沿设有进出水管。每锅可容装1200～1400袋(瓶)不等。土蒸锅形式简单，制作简易，可以就地取材，造价低廉，但杀菌时间较高压锅长。
2.蒸笼锅 蒸笼灭菌适宜于农村制种量小，条件差的单位。采用蒸笼灭菌时，密闭条件较差，由于锅内温度最高是100℃，所以灭菌时间从温度达100℃开始计时，需保持6～9小时。

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三、接种设备
接种设备，是指分离和扩大转接各级菌种的专用设备，主要有接种室、接种箱、超净工作台以及各种接种工具。
(一)接种室
接种室又称无菌室，是进行菌种分离和接种的专用房间。此室的设置不宜与灭菌室和培养室距离过远，以免在搬运过程中造成杂菌污染。生产量较大的菌种厂，应充分注意各个工作间的位置安排，总体布局参见下图。
接种室的面积一般5m２～6m２，高2m～3m即可，过大过小都难于保证无菌状态。接种室外面设缓冲间，面积约2m２。门不宜对开，最好安装移动门。接种室内的地面和墙壁要求光滑洁净，便于洗清消毒。室内和缓冲间装紫外线灯(波长265nm，功率30W)及日光灯各一支。 接种室具有操作方便，接种量大和速度快等优点，适宜于大规模生产。

(二)接种箱
缓冲室 接种箱是供菌种分离，移接的专用木制箱，实际上是缩小的接种室。接种箱有多种形式和规格，医药器械部门出售的接种箱，结构严密，设备完善，但价格较高。目前多数生产者采用木材和玻璃自己加工制作成一人或双人操作箱，其样式和大小大致。
接种箱内顶部装紫外线杀菌灯和日光灯各一盏。箱前(或箱后)的两个圆孔装上40cm长的布袖套或橡皮手套，双手由此伸入操作。圆孔外要设有推门，不操作时随即关门。箱体安装玻璃，木板均要注意密封，箱的内外均用油漆涂刷。
接种箱结构简单，制造容易，造价较低，移动方便，易于消毒灭菌，由于人在箱外操作，气温较高时也能维持作业，适合于专业户制作母种、原种。
(三)超净工作台
超净工作台是一种局部层流(平行流)装置，能够在局部造成洁净的工作环境。室内的风经过滤器送入风机，由风机加压送入正压箱，再经高效过滤器除尘，洁净后通过均压层，以层流状态均匀垂直向下进入操作区(或以水平层流状态通过操作区)，以保证操作区有洁净的空气环境。由于洁净的气流是匀速平行地向着一个方向。空气设有涡流，故任何一点灰尘或附着在灰尘上的杂菌，很难向别处扩散转移，而只能就地排除掉。因此，洁净气流不仅可以造成无尘环境，而且也是无菌环境。
使用超净工作台的好处是接种分离可靠，操作方便，尤其是炎热夏季，接种人员工作时感到舒畅。
(四)接种工具
接种工具是指分离和移接菌种的专用工具，样式很多。用于菌种分离＼母种制作和转接母种的工具，因大多在试管斜面和平板培养基上操作，一般是用细小的不锈钢丝制成。用于原种和栽培种转接的工具，因培养基比较粗糙紧密，可用比较粗大的不锈钢制成。

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四、培养菌种设备
培养菌种设备，主要是指接种后用于培养菌丝体的设备，如恒温培养室、恒温培养箱、摇床机等。
(一)恒温培养室
恒温培养室用于培育栽培种或培育较多的母种和原种。恒温培养室的大小，视菌种的生产量而定。室内放置菌种培养架。加温可采用电加温器或安装红外线灯加温，最好在电加温的电源上安一个恒温调节器，使之能自动调节温度。
(二)恒温培养箱
在制作母种和少量原种时，可采用恒温培养箱，根据需要使温度保持在一定范围内进行培养。市售的恒温箱多为专业厂家生产的电热恒温培养箱，使用比较方便，但价格较贵，而且购买和运输多有不便。因此可以用木板自己制造。自制恒温箱用一只大木箱做成，箱的四壁及顶、底均装双层木板，中间填充木屑隔水保温，底层装上石棉板或其它绝缘防燃材料，箱内装上红外线灯泡或普通灯泡加温，箱内壁安装自动恒温器，箱顶板中央钻孔安装套有橡皮塞的温度计以测试箱内温度。
(三)摇瓶机(摇床)
食用菌进行深层培养或制备液体菌种时，需设置摇瓶机。摇瓶机有往复式或旋转式两种。往复式摇瓶机的摇荡频率是每分钟80～120次，振幅(往复距)为8cm～12cm。旋转式的摇荡频率为每分钟180～220次。旋转式的耐用，效果较好。
五、实验室设备
具有一定规模的专业菌种厂，为了便于对菌种、培养料及其代谢产物进行检查、观察、化验和分析，有必要设置个普通的实验室。实验室常用的仪器设备有天平、干湿温度计、玻璃器皿和器具、孢子采集器、光学显微镜、电冰箱、冷藏箱及电热干燥箱等，可根据单位的具体条件设置。
(一)天平
天平的类型有多种，常用的托盘天平，又称架式天平，称量为1000g，感量1.0g(即精确度为士1.0g)；扭力天平，称量100g，感量为0.01g；分析天平，称量100g，感量0.1mg～1.0mg。
(二)干湿温度计
常用的是市售干湿球温度计，可同时观察环境的温度与湿度。将干球温度计的读数减去湿球温度计的读数得差数。旋转制动螺丝，对准其差数，差数与干球温度垂直交叉处的读数即为空气的相对湿度。例如，干球温度计的读数为22℃，湿球温度计的读数为19.5℃，干湿温度差2.5。在纵行22℃与横行2.5垂直交叉处的读数为73，即说明空气相对湿度73%。
自动记录温度计，能自动记录一天24小时内的温湿变化，因价格较贵，一般菌种厂很少购置。购买2支普通温度表(用前最好进行校对)，找一个薄木板，将2支温度表并列固定在木板上。 2支温度表中间留出10cm左右的间隔，以便安放盛水的小瓶。其中1支温度表的水银柱头，用易吸水的纱布条包裹扎牢，纱布的另一端放入装有清水的小瓶内作为湿球，即成为自制干湿球温度计。观测时先看干、湿温度计的度数，计算出干湿球温度差，再查看温湿度换算表即可。例如：干球温度计读数为18℃，湿球温度计读数为16℃，在温、湿度换算表纵行中查找18℃，再查横行干、湿温度差为2℃，其垂直交叉处的读数为76，即空气相对湿度为76%。温湿度换算见附表。无条件的单位自己可制造干湿球温度计。
(三)玻璃器皿和器具
常用的玻璃器皿有烧杯、烧瓶、培养皿、漏斗、量筒、酒精灯、称量瓶、试管、接管研钵等；其它器具有剪刀、镊子、试管架等。
(四)孢子采集器
是采取菌类孢子的一种专用装置，它是由有孔钟罩、搪瓷盘、培养皿、不锈钢丝支架和纱布等组成(见图4—8)。
(五)光学显微镜
采用一般双目或单目光学显微镜，观察菌丝的生长状况，分辨杂菌及病虫害的种类等。显微镜是贵重的光学仪器，使用时应严格操作程序，平时应避免和酸碱、氯仿、乙醚、酒精等放在一处，以免受腐蚀。
(六)电冰箱和冷藏箱
电冰箱和冷藏箱是冷冻器具中的两种小型冷藏设备，在食用菌制种中主要用于保藏菌种和其他物品。
(七)电热干燥箱
用于烘干测定产品及配料等的含水量，以及各种玻璃器皿的干热消毒。

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六、培养容器
培养食用菌的容器有玻璃容器和塑料容器两大类。玻璃容器透明度好，污染率低，但价格较高，且易损坏。其主要用于菌种分离、保存、鉴定和母种、原种的制作。塑料容器较轻便，成本低，但较易污染杂菌，且不易重复使用(薄膜容器)。其一般用来制作栽培种或直接用于栽培。具体品种、规格和用途见表4—１。
表４-１　　培 养 仪 器

种类	品名	常用规格	适用范围
玻 璃 容 器	试管 培养皿 三角瓶 菌种瓶	15x150，18x180，20x200mm 直径分别为9，10，12cm 150，300，500，1000 750mＬ	制作母种 分离菌种或鉴定用 摇瓶培养或其它 制作原种或栽培种
塑 料 容 器	聚丙烯广口瓶 聚丙烯塑料瓶 聚乙烯塑料瓶 塑料套环	750，800，1000mＬ 宽度12cm～17cm，长度不定 宽度12cm～17cm，长度不定 3.5cm x 3.5cm	制作栽培种或瓶栽用 制作栽培种或袋装用 用途同上，但不耐高温只可常压灭菌 套在塑料袋口上，代替瓶颈

在食用菌生产中,进行熟料栽培或制作栽培种,常常用到塑料袋。下面是选择塑料袋的根据和鉴别塑料袋的一般方法。
进行常压蒸气灭菌，可用聚乙烯塑料袋，厚度0.05mm～0.06mm(5～6丝)为宜。其中高压聚乙烯塑料袋透．明度高于低压聚乙烯塑料袋，但低压聚乙烯塑料的抗张强度是高压聚乙烯塑料的2.2倍(厚度相同时)，且低压聚乙烯能耐120℃高温。食用菌生产中应首先选用低压聚乙烯塑料袋。
　进行高压蒸汽灭菌时，宜用聚丙烯塑料袋，厚度0.06毫米(6丝)为宜。聚丙烯能耐1500℃高温，但其冬季柔韧性差，低温时使用应小心。
聚氯乙烯塑料有毒，不到100℃就软化。熟料栽培或制种时不能使用聚氯乙烯塑料袋。
塑料鉴别可采用简便易行的灼烧法。取少量样品，用镊子夹住，点燃，仔细观察塑料燃烧时的易燃性、离火后的特征、火焰特征、软化拉丝现象等，即可鉴别样品种类(表4—2)。
表４－２　　塑料燃烧特征

塑料名称	聚丙烯（ＰＰ）	聚乙烯（ＰＥ）	聚氯乙烯（ＰＶＣ）
燃烧状	易燃	易燃	难燃
离火后	继续燃烧	继续燃烧	熄灭
火焰特点	底部蓝色，顶部黄色	底部蓝色，顶部黄色	底部绿色，顶部浅绿色或黄色
燃烧现象	熔化淌滴，膨胀，有少量黑烟	熔化淌滴，无黑烟	软化，能拉白丝冒白烟
燃烧气味	石油味	燃烧蜡烛的气味	盐酸样刺激气味

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消毒与灭菌
微生物在自然界中无处不有，土壤里、水中、空气里、人体上、动植物体上以及培养食用菌的培养料、设备、工具上都有微生物存在。对食用菌来说，其中相当部分是有害的 。我们通常将这类有害的微生物统称为杂菌。人工栽培食用菌，要求丰产、稳产、优质，就要排除杂菌的危害和干扰，即彻底做好消毒灭菌工作是栽培成功的前提。
一、常用术语
消毒 消毒原是医学上的一个概念。它的原意是指杀死病原微生物，防止疾病传播。就食用菌生产而言，消毒是杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再危害食用菌的生长发育。经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等并不会完全死亡，它们仍能发芽，消毒后的环境里，物品上还会存活部分活着的微生物。
灭菌 是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把有生命的物质全部杀死。
杀菌 泛指杀死微生物菌体(不论是否有害)，一般不包括芽孢。具有这种效力的药剂称为杀菌剂。
抑菌　 即阻止菌体的生长繁殖。具有这种作用的药剂为抑菌剂。
无菌　 不存在任何活着的微生物。经过灭菌后的物品就是无菌的。
杂菌　 在某一培养基中，除了要求培养的微生物外，其他的微生物都称为杂菌。
防腐　 通过杀菌或抑菌达到防止物品腐败霉变的目的。具有这种效能的药剂称为防腐剂。
无菌操作 即操作的空间(如接种室、接种箱的空间)，使用的器皿和工具，操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。

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二、消毒与灭菌的方法
消毒与灭菌的方法很多，可分为物理方法和化学方法两大类。
(一)物理方法
1.干热法 在干燥的条件下，加热进行灭菌。
(1)灼烧灭菌 将物体置于火焰上，直接烧死附于物体上的微生物。此方法的特点是操作简便、灭菌迅速彻底。但应用范围有限，仅适用于耐热或供毁灭废弃的物品，如接种针、接种环、试管口或三角瓶口，可通过酒精灯火焰灼烧灭菌。严重污染杂菌的菇体和物体也可用火焰灼烧而灭菌。酒精灯用的酒精浓度以95%为宜，浓度低燃烧不良，热力不足，灼烧灭菌的效果差。
(2)干热灭菌 将需要灭菌的物品置于干燥箱中，加热到160℃，保持1～2小时，利用箱内的热空气杀死物体上的微生物。此法适用于玻璃器皿、金属用具等耐干热物品的灭菌。其优点是可以保持物品的干燥。
2.湿热法 是在有水的条件下加热。如用热水、热蒸汽杀死微生物。实验证明，细胞原生质在含水量高的情况下更易变性凝固，而且蒸汽的穿透力强，在同样温度下，湿热杀菌效果比干热法效果好。主要介绍经常用的巴斯德消毒法、间歇灭菌法、常压灭菌法和高压灭菌法。
(1)巴斯德消毒法 也称低温消毒法。即用较低的温度(60℃～700℃)杀死物品中的病原菌和大多数细菌白勺营养体。此法适用于不耐高温物品的消毒。栽培食用菌时常用的培养料发酵，即利用这个原理杀死其中的有害微生物。
(2)常压间歇灭菌法 利用流通的热蒸汽几次反复杀菌的方法。物品放在蒸锅或蒸笼内，加热至蒸汽上冒后，再继续蒸煮15～20分钟(根据不同的物品而定)，以杀死其中的微生物营养细胞。然后冷却，并将灭菌物取出，置室温下或25℃～30℃温箱中培养24小时，让其中芽孢萌发成营养体，再放入蒸锅中以同样的方法加热灭菌。如此连续三次，即可杀死灭菌物的全部芽孢，达到灭菌的目的。此法由于不需加压，只要有普通的家庭用蒸笼即可，但操作需用时间长。间歇灭菌法常用于不耐高温物品的灭菌。
(3)常压蒸汽灭菌法 又称流通蒸汽灭菌法。做法与间歇灭菌法相似，但需延长热处理的时间(4～8小时)，使物品中的微生物营养体和芽孢全部死亡，达到一次性灭菌的目的。此方法不仅可以灭菌，而且又有利于培养料中的有机质达到部分分解的目的，加之条件简易，操作方便，因此已被菇农用于制作原种、栽培种的培养基灭菌和熟料栽培的培养料灭菌。
(4)高压蒸汽灭菌 以上两种蒸汽灭菌法，由于是在常压下进行，蒸汽温度只有100℃左右，热处理较长。若利用密闭的蒸锅，使其中的蒸汽不外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，锅内温度也随之增加。这样杀灭细菌芽孢所需的时间可大大缩短，所以是一种最有效的灭菌方法。高压蒸汽灭菌时间短，效果可靠，适用于一般培养基和一切耐高温物品的灭菌。
3.紫外线灭菌 紫外线灭菌是利用辐射因素来灭菌的方法之一。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸会发生变化，当辐射量超过一定限度时，轻者突变，重者死亡。紫外线灭菌是用紫外线灯管进行的。紫外线的波长为200nm～300nm，均有灭菌效果，其中以260nm的杀菌能力最强。由于紫外线穿透物质的能力很差，所以只适用于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过1.2m为宜。接种室和接种箱，常用紫外线灯作为空气和桌面的消毒。紫外线对人的眼粘膜及视神经有损伤作用，应避免直接在紫外灯下工作，更不能直视灯管。
4.过滤除菌 对于不适宜用热力灭菌的液态和气态物质，可用过滤的方法除去其中的微生物。常见的试管口上加棉塞，就是起过滤除菌作用。
(1)液体过滤 有些培养基加热后，其中的某些成分易被分解，如血清、酶、维生素、抗生素及某些化学药品等，可用压滤或减压抽滤的方法，使之通过带有许多微小孔隙的过滤器，把其中的微生物阻隔在过滤板上除去。过滤器的种类很多，主要有瓷土制过滤器，硅藻土制过滤器、滤膜过滤器等。每种过滤器按孔径大小分成不同型号或等级，使用时可根据需要选择。
现以滤膜过滤器为例介绍具体安装和使用。滤膜是用火棉胶、醋酸纤维素或其他类似的物质制成，厚度0.1mm。将膜剪成与特制过滤器的漏斗直径大小相仿的圆片，置漏斗上，再将过滤器装在抽滤瓶上，以橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶(中间可连一水银检压计)，最后将安全瓶用橡皮管接于真空泵上(图4—6)。将待除菌的液体，以无菌操作注入滤器内，开动真空泵即可过滤。薄膜上的微孔直径有0.005um～1.０um等规格，滤除一般细菌，选用0.1um～0.2um的即可，过滤时间不宜过长，因低压能使屈曲运动的细菌通过滤器；也要避免高度减压，因微小颗粒会堵塞滤板，而失去过滤效能。一般以100mm～200mm水银柱减压为限。
(2)气体过滤 在生产液体菌种的深层发酵工艺中，需要大量无菌空气，采用气体过滤方法，使空气通过多层棉花和活，哇炭，滤除空气中的微生物。现许多发酵工业的厂家，已逐步采用超细玻璃纤维代替棉花和活性炭，其优点是体积小，使用方便，节省材料，但超细纤维滤纸不能受潮。

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(二)化学方法
　化学方法是用化学药品来杀灭或抑制杂菌的生长与繁殖。用于杀灭杂菌的药物称为消毒剂。消毒剂主要用于体表、器械和环境的消毒。理想的消毒剂应是杀菌力强、价格低、能长期保存、无腐蚀性、对人无毒或毒性较小的化学药品。
1.使用方法 要使消毒剂充分发挥杀菌效力，必须使化学药品成为气态或液态，才能获得消毒物品的最大接触面积。
(1)气态消毒法 用加热、焚烧、氧化等方法，使化学药剂为气体状态扩散到空中，杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需把要消毒的空间关闭紧密即可。另一种方法是把要消毒的物品放在特殊的密闭容器中，先抽净物品孔隙里的空气，再通入杀菌气体。这种方法杀菌彻底，且毒气不易外溢，但必须有一定的设备，如真空熏蒸消毒机等。一般用于剧毒药剂熏蒸和某些不耐热物品的彻底消毒灭菌。
(2)液态消毒法 是将消毒剂按一定的比例直接投入待消毒灭菌的溶液中，或先配制成一定浓度的药液，然后根据不同情况采用喷雾、擦拭、浸泡、涂抹或加入培养基等方法进行消毒或灭菌。
2.影响消毒剂作用的因素
不同的消毒剂其杀菌或抑菌不同。有的能使杂菌的蛋白质变性，有的可与杂菌的酶系统相结合而影响其代谢，有的则能降低细菌的表面张力，增加菌体细胞膜的通透性，使细胞破裂或溶解。影响消毒剂上述作用的主要因素有以下几种。
(1)环境条件的影响 消毒剂作用的温度和时间，对杀菌力的影响最为显著。一般讲，温度越高，杀菌效果越好，作用的时间越长，杀菌效果越好。此外，环境中如果存在着蛋白质等有机物，由于化学消毒剂与蛋白质的结合而引起消耗，而大大减弱消毒剂的效果。
(2)消毒剂的性质与浓度 消毒剂的化学性质决定其杀菌力，它必须溶解于水，方可渗入微生物体内而发挥作用。如升汞在水中解离度大，因而杀菌力也大。消毒剂的浓度也直接影响它的杀菌力，一般消毒剂的浓度越大，其杀菌力越强。但石炭酸和酒精浓度过高，反而不能达到杀菌的目的。
(3)微生物的种类与芽孢 不同微生物对各种消毒剂的敏感度不同，这主要是与其细胞的结构有关。因此，某一种化学消毒剂，对某一种微生物的消毒力，必须分别加以衡量，以便对症下药。此外，细菌的芽孢，对同一或不同化学药品的抵抗力，比其营养体大得多。所以，要达到彻底消毒的目的，切勿泛用化学消毒剂。
3.化学消毒剂的配制
(1)百分比浓度的计算 配制消毒剂时常用到百分比浓度。它的计算公式是：　　　　　　　　　　 溶质质量
溶液百分比浓度＝ x100%
溶质质量＋溶剂质量
溶质指被溶解的物质；溶剂指能溶解溶质的物质，水是最常用的溶剂；质量指重量，水的质量一般以1g／ml计算。
(2)溶液稀释的计算 由百分比浓度大的溶液配制成百分比浓度小的溶液，可用下面方法简便计算：

A D
↘↙
C
↗↖
B E

A为浓溶液的百分比数值；B为稀溶液的百分比数值(如果用水稀释则为0)；C为欲配制的百分浓度；D为配制时需要的浓溶液数量(D＝C—B)；E为需要的稀释液数量(E＝A—C)。
例如：欲将95%的酒精配制成75%的酒精，按此方法计算，用75份浓酒精加入20份水，即为75%的酒精。

95% 75=(75—0)
↘ ↙
75%
↗ ↖
0% 20=(95—75)

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(三)接种室与接种箱的消毒灭菌
主要介绍紫外线照射、福尔马林熏蒸和石炭酸喷雾三种方法。
1.紫外线照射 在每次接种前，应将所需的器具一并移入接种室(箱)内，然后打开紫外线灯进行灭菌。如果接种室的体积较大，开灯照射要达2小时才能收到灭菌效果；如果接种箱的体积较小，则开灯只需半小时左右即可达到灭菌效果。使用时应注意，当细菌接受致死量紫外线照射后，随即给予可见光照射，其中有一部分细菌又有可能复活(称光复活现象)。为此，经紫外线消毒后的空间，最好挂上黑窗帘(接种箱罩黑布)遮光半小时，以提高杀菌效果。照射时工作人员要离开室内(避免肉眼观看紫外线灯)，以防辐射影响身体健康。
紫外线消毒的优点是：使用方便，对多数物品无损害；消毒时不必专人看管，并可作为永久性设备。其缺点是：对真菌杀伤力差，穿透能力弱。
表4-2 常用化学消毒剂的使用

名称	用途	使用方法	注意事项
福尔马林（含甲醛37%～40%）	接种室、接种箱、培养室空间消毒或物体表面杀菌	①熏蒸法：房间关闭紧密，按6～8ml/m3的用量将福尔马林置碗内，加5g高锰酸钾氧化挥发，或直接加热蒸发至干。 ②喷雾法：按1：50的比例配成水溶液喷射在物体上	①福尔马林有白色沉淀时，可加几滴硫酸溶液 ②熏蒸法房间必要预先喷湿 ③对眼睛刺激性强，应注意防护
硫磺	接种室、接种箱、培养室空间消毒或物体表面杀菌	熏蒸法：按15g/m3的用量置磁碗内，用纸片引火点燃。房间同样需密闭。	①熏蒸前喷洒水雾，以增加杀菌效果 ②注意防止金属品锈蚀
乙醇 （酒精）	皮肤、器皿、分离材料的表面消毒	配成70%～75%的溶液擦拭	易燃，使用时注意安全
苯酚 （石炭酸）	接种室、接种箱空间消毒及物体表面杀菌	①配成5%溶液在空间或物体表面上喷雾 ②3%溶液用于器械浸泡	对皮肤有腐蚀作用
来苏儿（含煤酚皂47%～53%）	手及物体表面消毒	①3%溶液浸泡器皿1小时 ②1%～2%溶液擦洗接种箱、无菌室、用具以及手的浸泡
漂白粉	床架、地板、墙壁、用具等的消毒	配成2%～5%水溶液洗刷	杀菌效力持续时间短，应随配随用
高锰酸钾	床架、器皿等表面消毒	用0.1%～0.2%水溶液刷洗或浸泡	随配随用
新洁尔灭（含季胺盐5%）	皮肤和不耐热物品的表面消毒	用0.25%的水溶液刷洗或浸泡
升汞	分离材料、非金属物品的表面杀菌	用0.1%～0.2%水溶液刷洗或浸泡	①配制时，升汞先溶于浓盐酸（每克溶于2.5ml）再用水稀释 ②剧毒，使用时注意安全
冰醋酸（冰乙酸）	空间消毒、非金属物品的表面杀菌	①喷雾：浓度0.5%，空间5ml～8ml/m3。 ②熏蒸：密闭门窗，加热30分钟	易被碱性物质中和失效

2.福尔马林熏蒸 每立方米空间一般要用8mL福尔马林原液(市售含甲醛40%的水溶液)，高锰酸钾5g。先密闭门窗，量取相应的福尔马林置于容器中，然后加入相应的高锰酸钾，操作者随即离开接种室，熏蒸50分钟即能达到消毒灭菌的目的。也可直接加热福尔马林原液，使其蒸发进行熏蒸。无论哪一种方法熏蒸，都应隔天才能接种。
福尔马林熏蒸的优点是：杀菌力强，杀菌普广，性质稳定，耐贮存，受有机物影响小。缺点是：有一定的毒性和刺激气味，且受温度影响大。
3.石炭酸喷雾 工作之前，先用2%石炭酸溶液浸湿揩布，将接种室(箱)门窗、桌、凳及地面擦拭一遍，再用5%石炭酸溶液进行喷雾，以促使空气中的微粒和杂菌附着沉降，防止微尘飞扬，同时也起杀菌作用。
石炭酸喷雾的优点是：操作简易、性质稳定。缺点是：对皮肤有一定刺激性，只能作消毒剂。
接种箱较小，也可用0.1%的升汞溶液进行喷雾，达到消毒灭菌。升汞剧毒，使用时应注意安全。