新资源食品--蝉花菌丝体之开发

易菇

来源：《食药用菌》杂志  2011年第6期“台湾菇类产业专刊”
作者：葡萄王生技股份有限公司  许胜杰、叶淑幸、陈劲初


　　壹、蝉花简介
　　蝉花又名土蝉花、虫花、蝉草、蝉茸和胡蝉等，是由虫草属 (Cordyceps) 真菌 C. cicadae、C. sobolifera 或C. cicadicola 等真菌感染蝉科山蝉 (Cicada flammate )、蝼蛄 (Platypleura kaempferi )、黑蚱 (Crytotympana pustulata ) 及竹蝉 (Platylomia pieli ) 等幼虫，后于虫体头部形成花蕾状子座，故名蝉花。药用部位为其子座及寄主昆虫的尸体(菌核)。中国学者王琪、刘作易[1]将蝉花依不同的寄主及感染菌种分类(表1)为大蝉花或金蝉草C. cicadae、小蝉花C. sobolifera 及蝉草或蝉生虫草C. cicadicola 三种，并认为大蝉花才是真正的蝉花，但日本学者水野卓(1992)及中国学者陈以平等人研究蝉花子实体所使用或发表者皆为小蝉花 (C. sobolifera) [2]、[3]。蝉花多产于长江以南热带和亚热带地区，在中国为福建、浙江、四川、云南、江苏等地。而台湾亦有农民曾在花莲光复乡掘获野生子实体 (Fig. 1)。
　　蝉花之名最早见于南北朝刘宋时代之”雷公炮制论”中记载：凡使蝉花要白花全者。收得后于屋下悬干，去甲土后用浆水煮一日，至夜焙干，研细用之。野生蝉花之历史记载比冬虫夏草早了800年。蝉花入药已有一千多年的历史，根据宋朝苏颂的传统医书《图经本草》记载 “山蜀中，其蝉头上有一角，如花冠状，谓之蝉花。另据北宋唐慎微所著《证类本草》记载 ”蝉花味甘、性寒、无毒，具疏散风热、定惊解痉之效，主治小儿夜啼、心悸等症状。《本草纲目》亦记载”蝉花功同蝉蜕，又止疟疾”。传统常用方剂如「万应蝉花散」、「蝉花明目方」及「蝉花清热方」等，在《中华药物大全》和《中华药海》两部中药典籍中均有记载。在日本，亦早于1612年即初见蝉花之名于「多识篇」及小野兰山的「本草纲目启蒙」(1803)等文献。

　　贰、功能及成分
　　经分析蝉花含有腺苷、多种必需胺酸、甘露醇、多种生物碱及麦角甾醇等成分。人工培育的蝉花菌丝体中营养成分含甘露醇2.18％、多糖21.73％，其所含胺基酸、虫草多醣、甘露醇均与冬虫夏草相似[2]。比较冬虫夏草及蝉花二种传统药材之活性成分后发现，蝉花所含的虫草酸 (mannitol) 及腺苷(adenosine)含量均高于冬虫夏草，特别是腺苷含量为冬虫夏草的四倍之多[4]。蝉花子实体具有与冬虫夏草相似的化学成分，可能具有与冬虫夏草相似的药用价值。天然蝉花子实体及人工酦酵菌丝体皆有多种药理作用：

　　一、免疫调节作用
　　蝉花子实体含有半乳甘聚糖，依其与Con A亲和性高低将其分为亲和性高之 CI-A 及亲和性低之 CI-P，于动物实验中喂食 CI-A 1mg/kg/day连续十天后，发现具有抑制实验动物 Sarcoma 180肿瘤生长之功效，而 CI-P 则无此功效[3]。以蝉拟青霉菌株进行液态酦酵生产之蝉花多糖，有助于提升实验动物白血球之数量；减少脂质过氧化物的生成，维持还原型谷胱甘肽 (GSH) 的含量，具有清除自由基的能力；并对肺泡巨噬细胞有活化之作用[5]。以蝉花多醣体喂食高龄大鼠亦有助于增强其组织器官之免疫作用[6]。以蝉花多糖对小鼠进行淋巴转化及巨噬细胞吞噬等实验结果得知，蝉花多醣体具有提高免疫功能的作用[7]。另外，Fujita 等人从蝉花培养滤液中筛选获得了活性成分多球壳菌素 (ISP-1) (Fig. 2)。药理研究显示，ISP-1 具有显著的双向免疫调节作用，能阻断 IL-2 受体下游的途径，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶 (SPT) 活性，从而特异性抑制 T 细胞的增殖，而其抑制活性更为环孢菌素的 10~100 倍[8]。

　　二、抗疲劳作用
　　喂食小鼠蝉花子实体水煎剂能明显延长小鼠的游泳时间，于实验结果发现蝉花水萃液有助于提高在常压缺氧状态下及在高温环境下的小鼠的存活时间[9]。

　　三、镇静作用
　　以动物进行实验，蝉花组小鼠给药1小时后测定10分钟内自主活动次数，可显著的少于对照组。食用人工培养的蝉花子实体有助于延长的小鼠睡眠时间，同时缩短戊巴比妥钠的翻正反射消失时间，亦能增加在单位时间内的入睡率，同时证明人工培养品与天然蝉花具有相近的功效[9]。

　　四、改善肾功能
　　经药理研究证实天然蝉花子实体与冬虫夏草成份相近，而近年来许多的动物及临床实验研究发现，蝉花能有助于减轻各项慢性肾脏疾病之功效。以蝉花子实体进行临床实验的研究，发现每日饮用蝉花汤有助于改善慢性肾功能衰竭病人之血液及尿液中肌酸酐 (Creatinine) 清除率、改善血清蛋白含量及减少尿蛋白排出等功效，对早、中期慢性肾功能不全患者有一定程度的疗效。蝉花可以改善间质肾小管病变，能保护肾小管，改善肾血流动力学[10]。以固态培养蝉花菌丝 (C. sobolifera) 喂食肾小球硬化之实验大鼠，其结果显示喂食固体培养蝉花菌丝体能明显减少大鼠血清肌酸酐值(Serum creatinine / Scr)、尿素氮(Blood urea nitrogen, BUN)上升程度(P＜0.05)，减轻大鼠肾小球硬化程度，有助于推迟大鼠肾小球硬化进程和慢性肾衰竭进展速度[11]。另一方面，利用高糖模拟糖尿病患者体内的高糖环境，探讨了多球壳菌素 (ISP-1) 在糖尿病肾病肾脏肥大和早期肾硬化过程中所起的作用，结果显示，ISP-1 不但可有效抑制肾小球系膜细胞系肥大，并能明显减少细胞外基质分泌，因此有望将其用于治疗包括糖尿病肾病在内的肾小球硬化[12]。

　　五、降血糖
　　以天然蝉花子实体水萃浓缩液连续喂食糖尿病小鼠10天，对糖尿病小鼠和正常小鼠之空腹血糖值有显著降低之作用[13]。对正常小鼠投予50 mg/Kg蝉花粗多醣体 6小时后，其血糖值均有显示差异的下降[2]。

　　六、镇痛解热
　　柴一秋等人由蝉花的人工固体或液体发酵培养物中萃取而得到了一种腺苷衍生物N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine。此化合物为虫草的特有成分，可作为虫草制品的质量控制指针之一。此外，N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine可与 α 受体结合，抑制了神经递质释放而产生镇痛作用[14]。
   
　　七、抑制动脉粥样硬化形成
　　Hojjati 等人以 0.3 mg/kg 之 ISP-1 (多球壳菌素) 连续 60 天进行每隔一天注射于动脉粥样硬化大鼠，结果显示，ISP-1 对鞘脂类的合成有明显的抑制作用，实验大鼠之动脉硬化损伤面积明显减少。因此，ISP-1 的抑制丝氨酸棕榈酰转移酶 (SPT) 活性作用可能作为治疗动脉粥样硬化的一个选择[15 ]。

　　叄、蝉花菌丝体之开发
　　由于固态培养需耗费大量的人力，产品中带有多量未耗尽的基质，所以我们以液态酦酵大量培养生产蝉花菌丝体做为天然蝉花的代替品，并进行安全性试验及几种肾功能损伤保护模式之评估试验。

　　一、液态发酵之研究
　　蝉花菌能利用多种碳源，其中以葡萄糖及蔗糖培养生长最佳；氮源则以酵母萃出物最佳，培养温度为 24~26℃，其培养最适 pH约 5.0~6.0之间，以 5 吨发酵槽培养约需 3-5 天即可发酵完成，生物质量可达 2.0 %以上 (Fig. 3)。经减压浓缩后冷冻干燥，可得发酵全液干燥品，再经磨粉后即得蝉花菌丝体素材。

　　二、安全性评估试验
　　天然的蝉花子实体毒性低，自中国古代以来已有食用的纪录。上述酦酵生产的蝉花菌丝体已完成基因毒性试验、14 天的仔猪急毒性试验、 28 天及 90 天大鼠喂食毒性试验等安全性评估试验。在基因毒性试验方面，以 2.0 g/kg bw 剂量喂食 SD 大鼠其体外染色体毒性试验及动物体内微核试验，在染色体异常测试试验结果得知，蝉花酦酵菌丝体不会使受试小鼠其染色体数目改变及结构变异，也无骨髓抑制作用及对染色体损伤作用之现象，没有致突变作用。在体外鼷鼠淋巴瘤 tk分析法试验证实蝉花酦酵菌丝体亦没有明显细胞毒性，亦不会造成细胞株基因突变。而进一步将蝉花发酵菌丝体添加于离乳仔猪饲料中，进行 14 天的急毒性及其行为表现之评估试验。从实验结果得知，添加蝉花 5 % 于离乳仔猪之饲料中，连续喂食 14 天后不会引发仔猪急毒性之现象，对其生长性能表现上并无促进或危害之情形。在 28 天喂食毒性试验方面，分别以 2.0 g/kg bw 剂量之蝉花酦酵菌丝体连续喂食 Sprague-Dawley (SD) 品系大鼠 28 天及 90 天后，经血液及各项病理切片结果显示，均未对受试动物产生明显之毒性影响。

　　三、肾损伤保护模式之评估
　　1. 蝉花菌丝体对减缓gentamycin诱发大鼠肾脏损伤之保护作用：
　　Gentamycin为临床上常使用之抗生素，会引起10-20% 使用者肾小管坏死，导致肾衰竭，因此常被使用于探讨肾衰竭之模式。文献中常用剂量为120 mg/kg大鼠体重，在我们预实验中发现需160 mg/kg大鼠体重才能有明显伤害指标出现，故试验时，试验组先喂食蝉花一周，第二周起以160 mg/kg剂量注射大鼠并同时饲以蝉花。实验结果显示，于诱发肾损伤前先喂食蝉花菌丝体之大鼠 (Fig. 4)，经gentamycin诱发肾损伤后，发现其肾损伤程度小于未喂食蝉花或于诱发损伤后开始喂食蝉花之实验大鼠，其血尿中的尿素氮及血清肌酸酐、微白蛋白(microalbumin) 及NAG(N-Acetyl-β-D-glucosaminidase)等指标值较不易上升。其中无论是第三天或第七天之发酵液冻干品皆有此效果。另外，亦进行剂量效应分析及产品划分分析，发现喂食量低至50mg/kg仍有效果，而且将全液分成菌丝及滤液，发现两部份皆有效果。

　　2. 蝉花菌丝萃出物对减缓Lipopolysaccharide诱发大鼠肾脏损伤之保护作用：
　　Lipopolysaccharide (LPS)所引起之氧化压力来自于不正常的讯号传递、细胞失能、autophagy、apoptosis 及necrosis。其中与caspase有关之细胞凋亡，内质网压力(ER stress)及与Beclin-1/ LC-3有关之autophagy 已被证实在组织伤害上扮演重要角色。试验首先以PKI及MDCK两种分别为近端及远程肾小管细胞株进行测试，发现LPS对两者之毒杀性皆可因蝉花菌丝体水萃取物之添加而减缓 (Fig.6)，而其中，又以对远程肾小管细胞株在毒物处理下有较佳的存活率，亦即对LPS造成肾脏的毒害具有较佳之保护潜力。另一方面，在动物试验时以蝉花菌丝体水萃物喂食以LPS (Lipopolysaccharide ; E. coli O127:B8 )引发肾损伤之大鼠，发现蝉花菌丝体水萃物具有减缓经LPS刺激后之大鼠肾脏细胞伤害，能有效改善大鼠之肾血流量(Renal blood flow, RBF)及肾丝球过滤率(Glomerular filtration rate, GFR)，且对apoptosis、ER stress及autophagy三方面的伤害一均证明可以改善其个别相关指标蛋白质(Fig. 7) [16]。

　　3.蝉花菌丝萃出物对减缓cyclosporine诱发大鼠肾脏损伤之保护作用：
　　Cyclosporine为免疫抑制剂，常用于器官移植之病人以避免排斥作用，但亦有肾毒性。以蝉花菌丝萃取物375mg/Kg (300 mg水萃物+75mg 酒精萃取物) 连续饲喂大鼠两周后，连续注射25mg/kg/day之cyclosporine 7天，于注射期间持续喂食蝉花萃出物，结果发现因cyclosporine伤害导致之creatinine 及BUN清除率下降，皆可因喂食蝉花菌丝萃出物而改善。

　　4.以蝉花菌丝体对以STZ (streptozotocin)诱发SD大鼠糖尿病肾脏损伤之保护作用：
　　连续投予喂食蝉花发酵液冻干粉500 mg/Kg b.w. 12周，与 STZ 对照组相比，投予蝉花菌丝体组之肾组织中之超氧歧化酶(SOD)含量及过氧化氢酶(CAT)蛋白质表现量明显高于 STZ 对照组(Fig. 6)，另发现蝉花菌丝体可以明显的降低血糖 (Fig. 8) 及抑制 STZ 引起的TGF-β (transforming growth factor-β) 蛋白过度表现之现象，经结果得知蝉花菌丝体对于肾脏组织有保护功效及推迟伤害之功效，血中BUN 及creatinine 皆有降低，NO则有83%之减低，IL-6、TNF-α、肾脏MDA、尿中蛋白NF-κB、7GF-β亦皆有下降趋势，肾脏肿大情形亦获得改善[17 ]。
   
　　肆、结论
　　由于固态培养需耗费大量的人力，产品中带有多量未耗尽的基质，且以太空包培养之方式又有因高温长时间加热导致可能有塑化剂释出之疑虑，相较而言，以液态发酵培养蝉花菌丝体为一较安全并具节能环保之方式。保健食品之开发首重安全，发酵所得之蝉花菌丝体经基因毒性试验、14 天的仔猪急毒性试验、 28 天及 90 天大鼠喂食毒性试验等安全性评估，显示蝉花菌丝体具有很高之食用安全性。在功能性评估方面，蝉花菌丝体可以改善间质肾小管病变，能保护肾小管，改善肾血流动力学。同时，蝉花菌丝体具有缓解过高的血糖与肾损伤之指标，对于保护糖尿病肾损伤大鼠有显著的功效。蝉花与冬虫夏草同属虫生真菌复合体，且含有相近的化学成分，所以临床上常作为冬虫夏草的代用品。由于天然冬虫夏草产量日趋减少，而蝉花子实体亦不多，因此，蝉花菌丝体有机会开发成为维护肾脏机能之保健食品。

表1、常见蝉花菌种
Classification
Chinese name
Host
Cordyceps cicadae
大蝉花
Worm
Cordyceps sobolifera
小蝉花
Pupa
Cordyceps cicadicola
蝉草(蝉生虫草)
Adult

Fig 1. C. sobolifera (Hualien, Taiwan)

Fig 2. Structure of ISP-1.

Fig 3.Changes of mycelium biomass, residual sugar concentration and pH value in 5T fermentor of C. sobolifera .

Fig 4. The section showing cortex and medulla of Kidney, H&E stain.

Fig 5. The effects of Cs extract treatment on PK1 and MDCK cell viability after 24 hours of LPS injury.
LL: low dose of lipopolyasccharide (25 μg/ml);  HL: high dose of lipopolysaccharide (250 μg/ml)
LL+CS: low dose of lipopolysaccharide with Cs treatment
HL+Cs: high dose of lipopolysaccharide with Cs treatment

Fig 6. Statistical results for semiquantitive analysis of morphologic damage . Plasma blood urea nitrogen (BUN) (B) and creatinine (C) are displayed. * P<0.05 when compared to control group. # P<0.05 LPS+Cs vs. LPS group.

Fig 7. Comparison of apoptosis-related proteins: Bcl-2/Bax ratio, caspase 3 and PARP (A). endoplasmic reticulum stress-related proteins: GRP78 and caspase 12 (B) and autophagy-related proteins: Beclin-1 and LC3 (C) in the control (Co), LPS (L) and LPS+CS (L+C) treated groups.

Fig 8.  Blood sugar level of rats with different treatments