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菌种的保藏

　　一个优良的菌种被选育出来以后，要保持其生产性能的稳定、不污染杂菌、不死亡，这就需要对菌株进行保藏。
　　⒈ 菌种保藏的原理
　　菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。保藏时，一般利用菌种的休眠体(孢子、芽孢等)，创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到方法经济、简便。由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方法保藏较好，要根据具体情况而定。

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⒉ 菌种保藏方法
　　⑴ 斜面低温保藏法　本方法是利用低温降低菌种的新陈代谢，使菌种的特性在短时期内保持不变。将新鲜斜面上长好的菌体或孢子，置于4 ℃冰箱中保存。一般的菌种均可用此方法保存1～3个月。保存期间要注意冰箱的温度，不可波动太大，不能在0 ℃以下保存，否则培养基会结冰脱水，造成菌种性能衰退或死亡。
　　影响斜面保存时间的突出问题是培养基水分蒸发而收缩，使培养基成分浓度增大，造成“盐害”，更主要的是培养基表面收缩造成板结，对菌种造成机械损伤而使菌种致死。为了克服斜面培养基水分的蒸发，用橡皮塞代替棉塞，有比较好的效果，也可克服棉塞受潮而长霉污染的缺点。有人将2株枯草杆菌、1株大肠杆菌和1株金黄色葡萄球菌，分别接种在18×l80 mm试管斜面上，当培养成熟后将试管口用喷灯火焰熔封，置于4 ℃冰箱中保存了12年后，启封移种检查，结果除1株金黄色葡萄球菌已死亡，其余3株仍生长良好，这说明对某些菌种采用这种保藏方法，可以保存较长的时间。
　　⑵ 液体石蜡封存保藏法　在斜面菌种上加入灭菌后的液体石蜡，用量高出斜面1 cm，使菌种与空气隔绝，试管直立，置于4 ℃冰箱保存。保存期约1年。此法适用于不能以石蜡为碳源的菌种。液体石蜡采用蒸汽灭菌。
　　⑶ 固体曲保藏法　这是根据我国传统制曲原理加以改进的一种方法，适用于产孢子的真菌。该法采用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量的休眠体(孢子)后加以保存。该法的要点是控制适当的水分。例如在采用大米保藏孢子时，先取大米充分吸水膨胀，然后倒入搪瓷盘内蒸15 min(使大米粒仍保持分散状态)。蒸毕，取出搓散团块，稍冷，分装于茄形瓶内，蒸汽灭菌30 min，最后抽查含水量，合格后备用。将要保存的菌种制成孢子悬浮液，取适量加入已灭菌的大米培养基中，敲散拌匀，铺成斜面状，在一定温度下培养，在培养过程中要注意翻动，待孢子成熟后，取出置冰箱保存，或抽真空至水分含量在10％以下，放在盛有干燥剂的密封容器中低温或室温保存。保存期为1～3年。
　　⑷ 砂土管保藏法　本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于产孢子的放线菌、霉菌以及产芽孢的细菌。砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般为3:2或1:1，将黄砂和泥土分别洗净，过筛，按比例混合后，装入小试管内，装料高度约为1 cm左右，经间歇灭菌2～3次，灭菌烘干，并作无菌检查后备用。将要保存的斜面菌种刮下，直接与砂土混合；或用无菌水洗下孢子，制成悬浮液，再与砂土混合。混合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器中，用真空泵抽气干燥后，放在干燥低温环境下保存。此法保存期可达1年以上。
　　⑸ 冷冻干燥法　此法的原理是在低温下迅速地将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因而能长期保存，一般为5～10年。此法适用于各种微生物。具体的做法是将菌种制成悬浮液，与保护剂(一般为脱脂牛奶或血清等)混合，放在安瓿内，用低温酒精或干冰(-15 ℃以下)使之速冻，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿真空熔封，低温保存备用。
　　⑹ 液氮超低温保藏法　前面几种菌种保藏方法，在保存过程中菌种都有不同程度的死亡，特别对一些不产孢子的菌体保存的效果不够理想。微生物在-130 ℃以下，新陈代谢活动停止，这种环境下可永久性保存微生物菌种。液氮的温度可达-196 ℃，用液氮保存微生物菌种已获得满意的结果。液氮超低温保藏法简便易行，关键是要有液氮罐、低温冰箱等设备。该方法要点是：将要保存的菌种(菌液或长有菌体的琼脂块)置于10％甘油或二甲基亚砜保护剂中，密封于安瓿内(安瓿的玻璃要能承受很大温差而不致破裂)，先将菌液降至0 ℃，再以每分钟降低1 ℃的速度，一直降至-35 ℃，然后将安瓿放入液氮罐中保存。

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⒊ 菌种保藏的注意事项
　　菌种保藏要获得较好的效果，需注意如下三个方面：
　　⑴ 菌种在保藏前所处的状态　绝大多数微生物的菌种均保藏其休眠体，如孢子或芽孢。保藏用的孢子或芽孢等要采用新鲜斜面上生长丰满的培养物。菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量。培养时间过短，保存时容易死亡；培养时间长，生产性能衰退。一般以稍低于最适生长温度下培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。
　　⑵ 菌种保藏所用的基质　斜面低温保藏所用的培养基，碳源比例应少些，营养成分贫乏些较好，否则易产生酸，或使代谢活动增强，影响保藏时间。砂土管保藏需将砂和土充分洗净，以防其中含有过多的有机物，影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒的物质。冷冻干燥所用的保护剂，有不少经过加热就会分解或变性的物质，如还原糖和脱脂乳，过度加热往往形成有毒物质，灭菌时应特别注意。
　　⑶ 操作过程对细胞结构的损害　冷冻干燥时，冻结速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶，对细胞结构造成机械损伤。真空干燥程度也将影响细胞结构，加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏。细胞结构的损伤不仅使菌种保藏的死亡率增加，而且容易导致菌种变异，造成菌种性能衰退。

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第三节 工业微生物菌种的选育

　　用发酵法生产产品，首先要有一个良好的菌种。因此必须进行菌种选育工作。菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵的产量，促进了微生物发酵工业的迅速发展。通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、药用酶等产物的发酵产量提高了几十倍、几百倍、甚至几千倍。菌种选育在提高产品质量、增加品种、改善工艺条件和生产菌的遗传学研究等方面也发挥重大作用。菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。
　　菌种选育包括经验育种和定向育种，其中经验育种又分自然选育和诱变育种。在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变（亦称自然突变）而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育。由于野生菌株生产能力低，往往不能满足工业上的需要。因为在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖。但是，发酵工业生产，需要培养微生物使之积累大量的代谢产物。为此，采用种种措施来打破菌的正常代谢，对代谢流进行调节控制，从而大量积累我们所需要的代谢产物。例如青霉素的原始生产菌种产生黄色色素，使成品带黄色，经过菌种选育，生产菌不再分泌黄色色素；土霉素产生菌在培养过程中产生大量泡沫，经诱变处理后改变了遗传特性，发酵泡沫减少，可节省大量消泡剂并增加培养液的装量；红霉素等品种发酵遇有噬菌体侵袭时，发酵产量大幅度下降，甚至被迫停产，菌种经诱变处理获得抗噬菌体的特性，就可保证发酵生产的正常进行。

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⒉ 营养缺陷型的筛选方法
　　营养缺陷型（auxotroph）是指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。原养型（prototroph）一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型（wild type）相同，如能在基本培养基（MM）上生长，但基因型不一定相同。
　　营养缺陷型的筛选，一般是经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等步骤。中间培养的目的是减少以后筛选中再产生分离子，其培养基是完全培养基（CM）或补充培养基（SM），并且培养过夜。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。其目的在于浓缩缺陷型菌株。当诱变后的缺陷型数量较大时，也可省去中间培养和淘汰野生型等过程。营养缺陷菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。经过检出确定为营养缺陷型菌株之后，尚需进一步确定它的缺陷型是氨基酸、维生素，还是嘌呤、嘧啶缺陷型。
　　经过平皿初筛，确定营养缺陷或其他标记的变异性状后，即可进行发酵试验，检查其生产性状，经过生产性状比较，再平行试验比较，并结合生产的其他因素考虑，可确定用于生产或进一步改良诱变的菌株，进行保藏或扩大试验，直至用于生产等。

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⒉ 影响诱变效果的因素
　　除了出发菌株的遗传特性和诱变剂会影响诱变效果之外，菌种的生理状态、被处理菌株的预培养和后培养条件以及诱变处理时的外界条件等都会影响诱变效果。
菌种的生理状态与诱变效果有密切关系，例如有的碱基类似物、亚硝基胍(NTG)等只对分裂中的DNA有效，对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而另外一些诱变剂，如紫外线、亚硝酸、烷化剂、电离辐射等能直接与DNA起反应，因此对静止的细胞也有诱变效应，但是对分裂中的细胞更有效。因此，放线菌、真菌的孢子诱变前经培养稍加萌发可以提高诱变率。
诱变处理前后的培养条件对诱变效果有明显的影响。可在培养基中添加某些物质(如核酸碱基、咖啡因、氨基酸、氯化锂、重金属离子等等)来影响细胞对DNA损伤的修复作用，使之出现更多的差错，而达到提高诱变率的目的。例如菌种在紫外线处理前，在富有核酸碱基的培养基中培养，能增加其对紫外线的敏感性。相反，如果菌种在进行紫外线处理以前，培养于含有氯霉素(或缺乏色氨酸)的培养基中，则会降低突变率。紫外线诱变处理后，将孢子液分离于富有氨基酸的培养基中，则有利于菌种发生突变。
　　诱变率还受到其他外界条件，例如温度、氧气、pH值、可见光等的影响。

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㈢ 出发菌株的选择
　　突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。出发菌株的选择是诱变育种工作成败的关键。出发菌株的性能，如菌种的系谱、菌种的形态、生理、传代、保存等特性，对诱变效果影响很大。挑选出发菌株应考虑如下几点。
　　① 选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体（表型相同，基因型不同）的影响。从宏观上讲，就是要选择发酵产量稳定、波动范围小的菌株为出发菌株。如果出发菌株遗传性不纯，可以用自然分离或用缓和的诱变剂进行处理，取得纯种作为出发菌株。这样虽然要花一些时间，但效果更好。
　　② 选择出发菌株，不仅是选产量高的，还应该考虑其他因素。如产孢子早而多，色素多或少，生长速度快等有利于合成发酵产物的性状。特别重要的是选择的出发菌株应当具有我们所需要的代谢特性。例如，适合补料工艺的高产菌株是从糖、氮代谢速度较快的出发菌株得来的。用生活力旺盛而发酵产量又不很低的形态回复突变株作为出发菌株，常可收到好的效果。
　　③ 选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，不但可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。生产中经过长期选育的菌株，有时会对诱变剂不敏感。在此情况下，应设法改变菌株的遗传型，以提高菌株对诱变剂的敏感性。杂交、诱发抗性突变和采用大剂量的诱变剂处理均能改变菌株的遗传性而提高菌株对诱变剂的敏感性。

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　㈣ 筛选的方法
　　⒈ 制定筛选方案

图4-3　诱变筛选的典型流程
　　方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程，流程示意如图4-3。整个流程可按诱变和筛选两部分说明如下。
　　由出发菌种开始，制出新鲜孢子悬浮液(或细菌悬浮液)作诱变处理，然后以一定稀释度涂布平皿，至平皿上长出单菌落为止的各步骤为诱变过程。出发菌种的斜面非常重要。其培养工艺最好是经过试验已知的最佳培养基和培养条件。要选取对诱变剂最敏感的斜面种龄，要求孢子数适中而新鲜。在平皿内倾入10 mL左右的培养基，凝固后，加入一定量经诱变处理的孢子液，用涂布器涂匀后进行单菌落分离培养。
　　筛选过程主要包括传种斜面、菌株保藏和筛选高产菌株这三项工作。长出单菌落后，随机挑选单菌落进行生产能力测定。每一被挑选的单菌落传种斜面后，再由斜面接入模拟发酵工艺的摇瓶中培养，然后测定其生产能力。挑选生长良好的正常形态的菌落传种斜面，还可适当挑选少数形态或色素有变异的菌落。经诱变处理，形态严重变异的往往为低产菌株。经筛选挑出比对照生产能力高10％以上的菌株，要制成砂土管或冷冻管留种保藏。这一步非常重要，可保证高产菌株不会得而复失。诱变处理前后孢子要计数，以控制处理液的孢子数和统计诱变致死率，常用于处理的孢子液浓度为105～l08个／mL。孢子计数采用血球计数法在显微镜下直接计数。致死率是通过处理前后孢子液活菌计数来测定。

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⒊ 突变株的筛选
　　诱变处理后的孢子传种斜面后，进行生产能力测试筛选。为了获得优良菌株，初筛菌株的量要大，发酵和测试的条件都可粗放一些。例如可以采用琼脂块筛选法进行初筛，也可以采用一个菌株进一个摇瓶的方法进行初筛。随着以后一次一次的复筛，对发酵和测试条件的要求应逐步提高，复筛一般每个菌株进3～5个摇瓶，如果生产能力继续保持优异，再重复几次复筛。初筛和复筛均需有亲株作对照以比较生产能力是否优良。复筛后，对于有发展前途的优良菌株，可考察其稳定性、菌种特性和最适培养条件等。真正的高产菌株，往往需要经过产量提高的逐步累积过程，才能变得越来越明显。所以有必要多挑选一些出发菌株进行多步育种，以确保挑选出高产菌株。
　　根据形态变异淘汰低产菌株。突变一旦发生，突变细胞能够把突变的性状遗传给子代。如果诱变处理确实有效的话，在一定的培养基上，很容易发现一些菌落的性状或色泽等和亲代菌株不同，这可作为诱变效果的定性指标。某些菌落形态与生产性能有直接的相关性，可采取在平皿直接筛选。如在灰黄霉素生产菌的选育中，菌落暗红色变深者，产量就提高。但就目前的研究，多数变异其菌落外观形态与生理的相应关系尚未完全清楚。
　　根据平皿直接反应挑取高产菌株。所谓平皿直接反应是指每个菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物作用后的变色圈或透明圈等。因其可表示菌株的生产活力高低，所以可以作为初筛的标志，常用的有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂片法、深度梯度法。菌体细胞经诱变剂处理后，要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来，这需要有明确的筛选目标和筛选方法，需要进行认真细致的筛选工作。育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两种筛选方法。

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⑴ 随机筛选　随机筛选即菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，从中筛选高产菌株。为了提高筛选效率，可采用下列方法增大筛选量。
　　① 摇瓶筛选法。这是生产上一直使用的传统方法。即将挑出的单菌落传种斜面后，再由斜面接入模拟发酵工艺的摇瓶中培养，然后测定其发酵生产能力。选育高产菌株的目的是要在生产发酵罐中推广应用，因此，摇瓶的培养条件要尽可能和发酵生产的培养条件相近。但是，实际上摇瓶培养条件很难和发酵罐培养条件相同。摇瓶筛选的优点是培养条件与生产培养条件相接近。但工作量大、时间长、操作复杂。
　　② 琼脂块筛选法。这是一种简便、迅速的初筛方法。将单菌落连同其生长培养基(琼脂块)用打孔器取出，培养一段时间后，置于鉴定平板以测定其发酵产量。琼脂块筛选法的优点是操作简便、速度快。但是，固体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利用此法所取得的初筛结果必须经摇瓶复筛加以验证。
　　③ 筛选自动化和筛选工具微型化。近年来，在研究筛选自动化方面有很大进展，筛选实验实现了自动化和半自动化，省去了繁琐的劳动，大大提高了筛选效率。筛选工具的微型化也是很有意义的，例如将一些小瓶子取代现有的发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简便，又可加大筛选量。
　　⑵ 理性化筛选　传统的菌种选育是采用随机筛选的方法。由于正变异株出现的几率小，产量提高的范围往往在生物学波动的范围内，因而选出一株高产菌株需要耗费大量的人力、物力。而且，随着发酵产量不断提高，用随机筛选方法获得高产菌株的几率越来越小。近年来，随着遗传学、生物化学知识的积累，人们对于代谢途径、代谢调控机制了解得更多，因而筛选方法逐渐从随机筛选转向理性化筛选。理性化筛选是指运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。微生物的代谢产物不同，其筛选方法也有所不同