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第一章　绪　论

第－节　微生物及其特点

　　在生命世界中, 各种生物的体形大小相差极大，植物中的红杉高达350米，动物中的蓝鲸长达34米，而目前知道的最小微生物是病毒，如细小病毒的直径只有20 nm。
　　微生物是无所不在的物种，布满在自然界、动植物及人体，不过因其极为微小，看不见，摸不着，因此必须用显微镜放大几倍、几百倍、上千倍，乃至用电子显微镜放大数万倍、上百万倍才能看清。表示微生物大小的单位是μm（1 m＝106 μm）或nm（1 m＝109 nm）。球菌的直径是0.5 μm，因此80个球菌“肩并肩”地排列成横队，也只有一根头发丝的宽度。杆菌的长度约2 μm，故1500个杆菌头尾衔接起来仅有一颗芝麻长。最近在南极一个冰湖中发现了至少有2800岁的藻类和细菌，并成功使这些冰冻千年的微生物“苏醒”。
　　人体正常微生物与生俱来，伴随终生。微生物虽然微小，但数量庞大，一个人排出的粪便中，微生物约占干粪重量的40%左右，人从出生后就生活在有菌环境中，因此，皮肤以及与外界相通的腔道，如口腔、鼻咽腔、肠道、泌尿生殖道均有大量各类微生物寄居，成为人体不可缺少的一部分。寄居在人体的正常微生物丛一般情况下，对人体无害反有益，当然，在特定条件下也可致病。
一、微生物的定义及成员
　　微生物一词不是生物分类学上的专用名词，而是所有用肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。细胞是组成生命有机体基本的结构单位和功能单位，高等生物的个体是由许许多多的细胞所组成的, 如人体约由1800万亿个细胞组成。微生物的个体结构却非常简单, 大多数微生物是单细胞生物, 即一个细胞就是一个可以独立生活的微生物个体。少数微生物是多细胞, 还有一些微生物甚至连一个细胞都不是, 只是由蛋白质和(或)核酸组成的不能独立生活的大分子生物。显然, 它们是一群地球上最低等的生物。
　　综上所述, 如果要给微生物下一个比较恰切的定义, 则可以表述为：微生物是指所有形体微小，单细胞或结构简单的多细胞，或没有细胞结构的一群最低等的生物。
整个微生物家族的成员包括三大类：非细胞类微生物、原核细胞类微生物、真核细胞类微生物。现分述如下：
㈠ 非细胞类微生物
⒈ 真病毒
　　真病毒(euvirus)以活细胞内专性寄生(感染态)或以无生命的生物大分子(非感染态)两种形式存在, 由核酸和蛋白质组成的超显微的非细胞生物。 如人类病毒有：流感病毒、肝炎病毒、艾滋病毒(HIV)等；动物病毒有：腺病毒、鸡瘟病毒、口蹄疫病毒等；植物病毒有：烟草花叶病毒、番茄丛矮病毒等；原核生物病毒有：噬菌体。
⒉ 亚病毒
　　亚病毒(subvirus)只含核酸和蛋白质两种组分的其中一种的生物大分子病原体。包括类病毒(只含RNA, 专性活细胞内寄生)、拟病毒(仅由裸露核酸组成, 包裹于真病毒粒中)、朊粒(不含核酸的传染性蛋白质微粒)等。
㈡ 原核细胞类微生物
⒈ 细菌
　　细菌(bacteria)是结构简单的单细胞原核生物，一般要在普通光学显微镜下放大一千倍以上并染色才能清楚看见其个体。如人体肠道内的大肠杆菌、粪链球菌；用于酿醋的醋酸杆菌；使牛奶变酸的乳酸杆菌；生产味精的谷氨酸短杆菌；生产淀粉酶的枯草芽孢杆菌等。
⒉ 放线菌
　　放线菌(actinomycetes)呈丝状生长，营养菌丝为单细胞, 以孢子繁殖的一类原核生物,一般要采用油镜观察。如生产链霉素的灰色链霉菌，生产红霉素的红色链霉菌，生产庆大霉素的棘孢小单胞菌等。
⒊ 蓝细菌
蓝细菌(cyanobacteria)旧称蓝藻或蓝绿藻。呈单细胞、非丝状群体或丝状体的大型原核生物，能进行产氧光合作用。如发菜念珠蓝细菌，盘状螺旋蓝细菌(螺旋藻)等。
⒋ 支原体
　　支原体(mycoplasma)是一类不具细胞壁的最小型原核生物, 能在营养丰富的培养基上独立生活, 许多种类是致病菌。如肺炎支原体、生殖道支原体等。
⒌ 立克次氏体
　　立克次氏体(rickettsia)具有细胞壁的较大原核生物, 不能独立生活, 专性寄生于真核细胞内，是某些人类传染病的病原体。如斑疹伤寒立克次氏体、恙虫热立克次氏体等。
⒍ 衣原体
　　衣原体 (chlamydia) 的细胞壁缺肽聚糖, 缺乏产能酶系的原核生物，于真核细胞内营专性能量寄生的一类病原体。如沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体等。

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自然选育

　　自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。
⒈ 从自然界分离获得菌株
　　从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。
　　⑴ 采样　采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。如果预先不了解某种生产菌的具体来源，一般可从土壤中分离。采样的方法多是在选好地点后，用小铲去除表土，取离地面5～15 cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备考查。一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌的孢子忍耐不良环境的能力较强，不太容易死亡。但是，由于采样后的环境条件与天然条件有着不同程度的差异，一般应尽快分离。对于酵母类或霉菌类微生物，由于它们对碳水化合物的需要量比较多，一般又喜欢偏酸性环境，所以酵母类、霉菌类在植物花朵、瓜果种子及腐殖质含量高的土壤等上面比较多。
　　⑵ 增殖培养　收集到的样品，如含目标菌株较多，可直接进行分离。如果样品含目标菌种很少，就要设法增加该菌的数量，进行增殖(富集)培养。所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其它菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。例如筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳源进行增殖培养，使得不能分解纤维素的菌不能生长；筛选脂肪酶产生菌时，以植物油作为唯一碳源进行增殖培养，能更快更准确地将脂肪酶产生菌分离出来。除碳源外，微生物对氮源、维生素及金属离子的要求也是不同的，适当地控制这些营养条件对提高分离效果是有好处的。另外，控制增殖培养基的pH值，有利于排除不需要的、对酸碱敏感的微生物；添加一些专一性的抑制剂，可提高分离效率，例如在分离放线菌时，可先在土壤样品悬液中加10％的酚液数滴，以抑制霉菌和细菌的生长；适当控制增殖培养的温度，也是提高分离效率的一条好途径。
　　⑶ 纯种分离　通过增殖培养还不能得到微生物的纯种，因为生产菌在自然条件下通常是与各种菌混杂在一起的，所以有必要进行分离纯化，才能获得纯种。纯种分离方法常选用单菌落分离法。把菌种制备成单孢子或单细胞悬浮液，经过适当的稀释后，在琼脂平板上进行划线分离。划线法是将含菌样品在固体培养基表面作有规则的划线(有扇形划线法、方格划线法及平行划线法等)，菌样经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。也可以采用稀释法，该法是通过不断地稀释，使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都远离其他微生物而单独生长成为菌落，从而得到纯种。划线法简单且较快，稀释法在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的概率大，特别适宜于分离具有蔓延性的微生物。采用单菌落分离法有时会夹杂一些由两个或多个孢子所生长的菌落，另外不同孢子的芽管间发生吻合，也可形成异核菌落。要克服这些缺点，就要特别重视单孢子悬浮液的制备方法。为使单孢子悬浮液有良好的分散度，力求去除菌丝断片或粘接在一起的成串的孢子，可采用如下方法制备单孢子悬浮液：① 对于细菌，因其在固体斜面培养基上常粘在一起，故要求转种到新鲜肉汤液体中进行培养，以取得分散且生长活跃的菌体；② 对放线菌和霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振荡打散孢子后，用滤纸或棉花过滤；对某些黏性大的孢子，常加入0.05％的分散剂(如吐温80，Tween 80)以获得分散的单个孢子。
为了提高筛选工作效率，在纯种分离时，培养条件对筛选结果影响也很大，可通过控制营养成分、调节培养基pH值、添加抑制剂、改变培养温度和通气条件及热处理等来提高筛选效率。平板分离后挑选单个菌落进行生产能力测定，从中选出优良的菌株。
　　⑷ 生产性能的测定　由于纯种分离后，得到的菌株数量非常大，如果对每一菌株都作全面或精确的性能测定，工作量十分巨大，而且是不必要的。一般采用两步法，即初筛和复筛，经过多次重复筛选，直到获得1～3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，进而作为育种的出发菌株。这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株，以区别于用人工育种方法得到的变异菌株（亦称突变株）。
⒉ 从自发突变体中获得菌株
　　一般微生物可遗传的特性发生变化称为变异，又称突变，是微生物产生变种的根源，同时也是育种的基础。自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。目前，发酵工业中使用的生产菌种，几乎都是经过人工诱变处理后获得的突变株。这些突变株是以大量生成某种代谢产物(发酵产物)为目的筛选出来的，因而它们属于代谢调节失控的菌株。微生物的代谢调节系统趋向于最有效地利用环境中的营养物质，优先进行生长和繁殖，而生产菌种常常是打破了原有的代谢调节系统的突变株，因此常常表现出生活力比野生菌株弱的特点。此外，生产菌种是经人工诱变处理而筛选获得的突变株，遗传特性往往不够稳定，容易继续发生变异，使得生产菌株呈现出自然变异的特性，如果不及时进行自然选育，通常会导致菌种性能变化，使发酵产量降低，但也有变异使菌种获得优良性能的情况。
　　自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要，不完全符合工业生产的要求，如产量低、副产物多、生长周期长等。因而不能仅停留在“选”种上，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株，这种方法就称为诱变育种。

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诱变育种的程序

　　诱变育种和其他方法相比较，人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，在生产中使用得十分普遍。但是诱发突变随机性大，因此诱发突变必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的效果。如果筛选方法得当，也有可能定向地获得好的变异株。
　　诱变育种的主要环节是：① 以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液(细胞或孢子)，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高；② 用合适的方法淘汰负变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。诱变育种的程序如图4-1所示。

图4-1　诱变育种的程序

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第四章　生物工业菌种与种子的扩大培养

第一节 工业生产常用的微生物及要求
　　微生物的资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向突变菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。由于发酵工程本身的发展以及基因工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步地变为工业生产用的微生物。尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10％左右。微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模生产的不超过一百多种；微生物酶有近千种，而工业利用的不过四五十种。可见潜力是很大的。
　　微生物的特点是种类多，分布广；生长迅速，繁殖速度快；代谢能力强；适应性强，容易培养。工业生产中，也可根据微生物的特点选择适宜的微生物。

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工业生产常用的微生物

　　⒈ 细菌
　　细菌(bacteria)是自然界分布最广、数量最多的一类微生物，属单细胞原核生物，以较典型的二分分裂方式繁殖。细胞生长时，环状DNA染色体复制，细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体分开，继而间隔分裂形成两个相同的子细胞。如间隔不完全分裂就形成链状细胞。
　　工业生产常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等等。
　　⒉ 酵母菌
　　酵母菌(yeast)为单细胞真核生物，在自然界中普遍存在，主要分布于含糖较多的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母较多地分布在油田周围的土壤中。酵母菌多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖，母细胞体积长到一定程度时就开始发芽。芽长大的同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的两细胞，如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝。在发酵生产旺期，常出现假菌丝。
　　工业上用的酵母菌有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。分别用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶(lipase)以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。
　　⒊ 霉菌
　　霉菌(mould)不是一个分类学上的名词。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌统称为霉菌。霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性，多腐生，少数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，多以无性孢子繁殖为主。其生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网状。菌丝的长度既受遗传性的控制，又受环境的影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。
工业上常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等。它们可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素(steroid hormone)等。
　　⒋ 放线菌
　　放线菌(actinomycetes)因菌落呈放线状而得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较广。大多腐生，少数寄生。放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体浸没培养中。其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成为菌丝体。菌丝长度既受遗传性的控制，又与环境相关。在液体浸没培养中由于搅拌器的剪切应力作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。它的最大经济价值在于能产生多种抗生素(antibiotic)。从微生物中发现的抗生素，有60％以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡菌属等。
　　⒌ 担子菌
　　所谓担子菌(basidiomycetes)就是人们通常所说的菇类(mushroom)微生物。担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中1,2-β-葡萄糖苷酶及两种糖类物质具有抗癌作用。
　　⒍ 藻类
　　藻类(alga)是自然界分布极广的一类自养微生物资源，许多国家已把它用作人类保健食品和动物饲料。培养螺旋藻，按干重计算每公顷(1 ha = 104 m2)可收获60 t，而种植大豆每公顷才可收获4 t；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆的28倍。培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20～35倍。此外，还可通过藻类将CO2转变为石油，培养单胞藻或其它藻类而获得的石油，可占细胞干重的5％～50％，合成的油与重油相同，加工后可转变为汽油、煤油和其它产品。有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷地，培植的单胞藻按5％干物质为碳水化合物(石油)计算，可得60 t石油燃料。此项技术的应用，还可减轻因工业生产而大量排放CO2造成的温室效应。国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢来获取氢能。

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微生物工业对菌种的要求

　　目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多的新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种则有下列要求。
　　⑴ 原料廉价、生长迅速、目的产物产量高；
　　⑵ 易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短；
　　⑶ 抗杂菌和噬菌体的能力强；
　　⑷ 菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。

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第二节　工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏 微生物菌种的衰退

　　⒈ 菌种衰退的原因
　　菌种衰退的原因有两个方面：一是菌种保藏不妥；二是菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。
　　菌种的衰退会使微生物个体和群体特征的各个方面发生变化，其中最重要的是使所需产物的生产产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境条件的性能减弱等。菌种的退化不同于培养过程中由环境条件变化引起的表面的、暂时的变化，而是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致整个菌株衰退的一个从量变到质变的遗传变异过程。
　　菌种连续传代是菌种发生衰退的直接原因。由于连续传代使菌种经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是在不断地变化，与处于休眠状态的菌种相比，细胞的自发突变率要高得多。因此，菌株经过连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。培养基灭菌升、降温的不同，培养基存放时间的不同，采用老龄菌和多核菌丝传代等都比较容易引起菌种衰退。
　　菌种的保藏主要是通过控制低温、干燥、缺氧等条件，使微生物营养体或休眠体处于不活泼的状态，维持最低代谢水平，尽可能保证活力和不发生变异。但是，各种菌种的保藏法对阻止菌种变异的效果不尽相同，用效果较差的条件保藏菌种时，菌种就较易发生衰退。此外，保藏操作不当也会影响保藏效果，甚至导致菌种的变异。
　　菌种自身突变引起菌种衰退。菌种的自发突变和回复突变是引起菌种自身衰退的主要原因。微生物细胞在每一世代中的突变概率一般为10-8～10-9，保藏在0～4 ℃时这一突变概率更小，但仍然不能排除菌种衰退的可能。诸如对营养缺陷型菌种未充足供给所需营养物，菌种就会发生突变而丧失已有的特性。
　　菌种的回复突变是指突变菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，表现出原育种过程中已获得的优良性状的退化。
　　突变不完全造成菌体遗传组成的差异。对于单核细胞的菌株，菌体内的DNA双链中仅有一条链发生位点突变，并复制成变异菌的DNA链，而未发生变化的一条链，复制成原菌的DNA链，结果形成不纯的菌落，经移植后表现出菌种的衰退现象。同样，对于具有两个核以上细胞的菌株，如果只有一个或几个核发生变异，将会产生异核菌丝，不纯的异核菌丝分裂，便会形成性状不同的菌丝，而一旦性状不同的菌丝占优势，就将表现出菌株的衰退，而不再具有优良的性状。
　　如果菌落不是由一个孢子或一个细胞形成，当其中只有一个高产突变的孢子或细胞，通过移植后，高产菌株数量就比较少，表现出菌种衰退。

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⒉ 菌种性能的改变
　　⑴ 菌种遗传特性的改变 从菌种遗传机理这一微观角度来看，菌种遗传特性的改变主要有如下三个原因。
　　① 异核现象导致微生物群体发生变异。某些菌丝生长时会和邻近的菌丝细胞间发生吻合，形成异核菌丝体(简称异核体)，即在一条菌丝里含有几个遗传特性不同的细胞核，共同生活在均一的细胞质里。异核体可以由遗传性不同的菌丝吻合后形成，也可由多核菌丝中个别核发生突变而产生。异核体所产生的单核或多核的孢子具有不同的遗传特性和不同的生长繁殖速度，其结果是伴随着菌种传代培养，菌种的遗传特性发生改变。在菌种选育过程中，许多从培养基中新分离出来的丝状菌是异核体。在抗生素生产中，从产生单核分生孢子的异核体进行单孢子自然分离，可以得到同核的单菌落，其中很多表现出稳定的生产能力。
　　② 自发突变导致菌种遗传特性改变。由于DNA在复制过程中会出现偶然的差错，以及环境中某些物质和某些微生物自身的代谢产物对微生物有刺激作用，菌种以很低的频率发生自发突变。
　　③ 突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种往往不稳定，容易发生回复突变或产生分离子，以致在菌种这一群体中形成具有不同基因型（亦称遗传型）的个体。
　　以上是导致菌种变异的遗传因素，这些因素将通过环境得以表现。生产菌种在使用过程中，需要在人工培养条件下进行传代，虽然原始斜面菌种是由单菌落发育而来，但菌落上的许多分生孢子已经具有不同的遗传基础，所以菌种的性状实际上是孢子群体的特征。较纯的群体，传代后变异较少；不纯的群体，传代后变异较多。在菌种传代培养过程中，导致菌种遗传特性改变的以上几个原因都可起作用，其结果使群体中变异菌株增多。传代培养还具有某种选择作用。通常所说的菌种优良性状和大量生成目的产物的有关的高产菌株往往表现出生活力弱、生长繁殖速度慢的特点。这些特点使得传代培养实质上具有富集低产菌株的作用。所以，菌种传代次数过多会导致菌种衰退。此外，菌种保藏条件不当也会使菌种发生变异。在菌种保藏过程中采用的一些手段，例如冷冻干燥，会对菌体细胞的结构和DNA造成损伤，在修复这些损伤时，菌体就可能发生变异。
　　⑵ 菌种生理状况的改变　菌种的遗传特性需要在一定条件下才能表现出来。由于培养条件不适当，使菌种处于不利于发酵生产的生理状况，其结果也表现为菌种衰退。菌种处于不利于发酵的生理状况有以下三个方面的原因。
　　① 一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异株混合组成，这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。一个由单菌落发育而来的菌种在固体培养基上分离，可以长出许多种形态培养特征的菌落。这些不同的菌落类型在代谢和生长繁殖速度等方面有一定差异。培养条件可以影响各变异株在培养物中的比例而改变该菌种的特性。同一个菌种的单孢子分离在不同的培养基上，所生长出的单菌落，其形态培养特征有显著差异，各种类型菌落所占的比例也不同。如灰色链霉菌(Streptomyces griseus)在豌豆琼脂培养基上，单孢子分离呈现出3～4种菌落类型，而在黄豆粉培养基上仅出现两种菌落类型。在开始菌种选育工作时，要研究单菌落的分离培养基，找出能呈现较多菌落类型的分离培养基。菌落类型和发酵产量之间存在着某种程度的相关性。在选种实践中，人们经过对菌落形态的考察，有意识地丢弃一些被认为是低产的菌落，挑选那些可能是高产的菌落。
　　② 菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成，因而影响发酵。菌种培养基营养贫乏也同样不利于发酵。因为菌种在营养贫乏的培养基中多次传代，会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰老甚至死亡。因此，自然选育或菌种培养所用的培养基应选择具有菌种传代后生产能力下降不明显、菌体不易衰老和自溶的正常形态菌落、孢子丰富的培养基。
　　③ 在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变。这种改变可能以类似于生理性迟延或细胞分化的机制保持较长一段时间。
由于菌种的衰退将会引起发酵过程的产量急剧下降，一旦发生菌种衰退，就必须采取有效的预防和防治措施，防止菌种的优良性状发生退化。同时若发现某些优良性状退化，应及时进行分离纯化，使生产菌种保持稳定的优良特性。防止菌种衰退的措施主要有菌种的复壮、提供良好的环境条件、定期纯化菌种、防止自身突变等各个方面。

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⒊ 防止菌种衰退的措施
　　要防止菌种衰退，应该作好保藏工作，使菌种优良的特性得以保存，尽量减少传代次数。如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进行分离复壮。
　　⑴ 菌种的分离　菌种发生衰退的同时，并不是所有的菌种都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的、具有更强生命力的菌体。因此，采用单细胞菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平板划线法，以取得单细胞所长成的菌落，再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来性状的菌株，甚至性能更好的菌株。如对芽孢杆菌，可先将菌液用沸水处理几分钟，再用平板进行分离，从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。如果遇到某些菌株即使进行单细胞分离仍不能达到复壮的效果，则可改变培养条件，达到复壮的目的。如AT3.942栖土曲霉的产孢子能力下降，可适当提高培养温度，恢复其能力。同时通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。
　　菌种分离方法如下：
　　① 配合一定的培养条件，对退化菌株进行单菌落或单细胞分离，淘汰退化的个体，保留纯化菌种。
　　② 将芽孢杆菌的悬液加热至90 ℃处理数分钟，杀灭已退化的菌体，保留芽孢；再将芽孢或孢子进行传代，以淘汰退化的个体。
　　③ 提供特殊的培养条件，使环境有利于优良性状菌株的生长而不利于退化菌株的生长，从而淘汰已退化的菌株个体。
　　④ 将分离后得到的初筛菌株先保藏，再进行复筛考察，从中选出稳定性较好的菌种。
　　⑤ 同时应用上述方法中的两种或两种以上的方法，会收到更好的复壮效果。
　　⑵ 菌种的复壮　菌种的复壮有狭义的复壮和广义的复壮。狭义的复壮指的是菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。而广义的复壮应该是一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种的生产性能逐步提高，所以，这实际上是一种利用自发突变(正突变)从生产中不断进行选种的工作。
　　⑶ 提供良好的环境条件　进行合理的传代，减少传代次数可防止由于菌种的遗传稳定性变化而引起的自发突变，以及由于环境条件变化导致的退化。菌种允许使用的传代次数必须通过传代的稳定性试验确定。发酵生产上一般只用三代内的菌种。采用合适的传代条件使培养条件有利于高产菌的生长，而不利于低产菌的生长，减少突变的发生。
　　⑷ 用优良的保藏方法　尽可能采用诸如斜面冰箱保藏法、砂土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法以及采用干孢子保藏等优越的保藏方法保藏菌种，以防止菌种的衰退。
　　⑸ 定期纯化菌种　对菌种进行定期的分离纯化，可减少其中共存的自发突变菌或“突变不完全”产生的退休型菌株的增殖机会，保持原来的优良特性。诸如对营养缺陷型菌种在纯化过程中提供足够的营养物，以保持菌株的优势，避免回复突变体的竞争。同样在进行抗性突变的菌种纯化时在培养基中加入对应于抗性的药物，可保持菌株的抗性优势，避免产生无抗性的回复突变体。
　　采用遗传性稳定的菌体作为菌种、合适的培养基传代等可减少和防止菌种的自身突变。

生态无极

1. 菌种的复壮

　　⑴ 纯种分离　通过纯种分离，可把退化菌种中的一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经过扩大培养，就可恢复原菌株的典型性。常用的菌种纯化方法很多，大体上可把它们归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平上来说是纯的，例如在琼脂平板上进行划线、表面涂布或与琼脂培养基混匀以获得单菌落等方法；另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法，它可以达到“细胞纯”即菌株纯的水平。后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室，也有利用复杂的显微操纵器的菌株分离方法。如果遇到不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端以截取单细胞而进行纯种分离。
　　⑵ 通过寄主体进行复壮　对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动物寄主体内以提高菌株毒性。如经过长期人工培养的杀螟杆菌，会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，这时可将衰退的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离菌株。如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。
　　⑶ 淘汰已衰退的个体　有人曾对“5406”菌种采用在低温(-30～-10 ℃)下处理其分生孢子7天，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。
　　以上综合了在实践中收到一定效果的一些防止衰退和达到复壮的措施。但是，在使用这类方法之前，还要仔细分析和判断菌种究竟是衰退、污染还是仅属一般性的表型改变，只有对症下药才能使复壮工作奏效。