[推荐]微生物与发酵工艺知识大全

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　5. 高密度细胞培养(high cell density culture)
　　一般是指在液体培养中细胞含量超过常规培养10倍以上的发酵技术。在采用毕赤酵母高密度细胞发酵时，生物量达到100g干重/L，代谢物的产量也大为提高，所以该技术能大大提高生产产率，并提高产物的分离和提取效率。但要达到高密度细胞培养，不仅要选育适合的菌种，而且在培养工艺技术上必须作相应的改进，如培养基的成分和比例的优化；补料技术的采用；溶氧浓度的提高和防止有害产物的生成等。图3-13是采用毕赤酵母高密度细胞发酵的对比照片。

图3-13　高密度细胞培养

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6. 双菌或多菌培养
　　现代发酵工业以纯种发酵为主，而传统的固态白酒和酱油的发酵都是多菌培养发酵的结果。在自然界微生物之间的共生与互生关系也是双菌与多菌共同生存的常例，这种关系反映了微生物存在着代谢“接力捧”的依赖状态，能相互改善生存条件。
　　维生素C的二步法生产是发酵工业双菌发酵的典型例子。如采用欧文氏菌(Erwinia sp.) 和棒状杆菌(Corynebacterium sp.)进行串联发酵，先将D-葡萄糖转化成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸，再进一步转化产生2-酮基-L-古龙酸。另一路线是从葡萄糖高压加氢制成的D-山梨醇是发酵的主要原料,利用生黑葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter melanogenus)或弱氧醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)先进行第一步发酵,所生成的L-山梨糖(醪液)于80℃加热几分钟后再加入消过毒的辅料(玉米浆,尿素及无机盐等),即可开始第二步的混合菌株发酵.初期pH约为7.0,两株菌生长均很正常;当作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时，产酸菌株(Gluconobacter oxydans)开始产酸。
　　许多发酵是纯菌株无法实现的，只有混合菌株才能完成，所以采用混菌培养有可能获得新型的或优质的发酵产品，有时比单菌培养反应更快、更有效，更简便，当然混菌培养的反应机制较复杂。

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三、微生物生长的测定
　　描述微生物生长，对不同的微生物和不同的生长状态可以选取不同的指标。通常对于处于旺盛生长期的单细胞微生物，既可选细胞数，又可以选细胞质量作为生长指标，因为这时这两者是成比例的。对于多细胞微生物的生长（以丝状真菌为代表），则通常以菌丝生长长度或者菌丝重量作为生长指标(图3-14)。

图3-14　霉菌菌丝生长（图中的数字为分钟）
常用的测定或估计微生物生长的方法有下列几种(表3-24)。
（一）计数器法亦称血球计数板法（适用于单细胞）
　　对酵母用Thoma血球计数板，对细菌用Petriff-Hausser计数器或Helber计数器，直接在显微镜下计数。这些计数器的底面都有棋盘式刻度，可以数一定面积内的菌数。Thoma计数小室和细菌计数小室的深度分别为0.1mm和0.02mm。每个方格的体积分别为2.5x10-4mm3和5x10-8mm3。 Petroff-Hausser计数小室的玻璃要薄一些，以便于进行暗视野照明。
　　对细菌来说，视野照明的强弱也是重要的。不管是计数盘底上的菌还是上面存在的少数细菌，都要操纵微调装置，看清楚后加以计算，不要漏掉。对能运动的细菌，一般可以设法用4%聚乙烯醇停止其运动。
表3-24　常用菌数计数法比较

（二）平皿活计数法
　　这是采用平皿涂布或混合试样和培养基长出菌落测定活菌数的方法。其操作过程是试样
的逐级稀释和在培养基上涂布或试样与融化培养基混合，培养后计数菌落数，由于每一菌落系由一个细胞繁殖而成，故可按稀释度与加入试样量计算出活菌数。不过也并非所有的微生物都能在人工培养基上生长成菌落，这是个限制，也是必然要逐步解决的重要课题。
表3-25　为可能被培养微生物的比例。
表3-25　一些地域可能被培养微生物的比例

　　平皿活计数法的稀释倍数很重要，因为每个平皿上长出的菌落数对数据的正确性影响很大，一般要求一个直径9cm的平皿上长出30-300个菌落，两稀释倍度之比接近1为佳。
表3-26为稀释度选择与菌落总数的记录方式。
表3-26　稀释度选择与菌落总数的记录方式

注：
　　 1．以选取菌落数30、300之间的培养皿作为菌落总数测定的依据。酵母、细菌可采用菌落数偏大者，而霉菌则应选取菌落数偏小者。如：根、毛霉菌偏多，可于培养基内加入0．1%去氧胆酸钠，以限制它们迅速扩展。总之，菌落计数应以菌落间各个分开为度(例1)。
　　2．若有两个稀释度，其生长的菌落均在30～300之间，则应视两者之比如何来决定。若其比值小于2，则应取其平均值；若大于2，则取其较小数(例2及例3)。
　　3．若所有的稀释的平均菌落数大于300，或重行再次稀释分离培养，或取稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数为菌落数(例4)。
　　4．若所有的稀释度的平均菌落数均小于30，或重行再次稀释分离培养或取稀释度倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数，定为菌落数(例5)。
　　5．若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近30成300的平均数乘稀释倍数(例6)。
　　6．菌落数在100以内，按实有数记录，若大于100时，采用二位有效数，二位有效数后的数值，以四舍五入法计算。一般以10的指数表示。

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1. 常用于大肠杆菌最可能数(MPN)液体试菅稀释法

　　将检样以无菌操作接种于乳糖胆盐发酵管内，采用3个稀释度正[1m1(g)、0.1m1(g)和0.0lml(g)]，每稀释度3管。置44±0.5℃水浴内，培养24±2h，经培养后，若乳糖胆盐发酵管有产气者，则进行证实试验。将所有产气发酵管，分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养18-24h，并同时接种蛋白胨水，置44±0.5℃培养24h。在上述平板上观察有无典型菌落生长，并做革兰氏染色镜检。在蛋白胨水内加入靛基质试剂约0.5ml，观察靛基质反应。凡靛基质阳性，平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100m1(g)粪大肠菌群的最可能数。
（四）比色（比浊）法
　　细胞悬浮液的浑浊度通常采用光波长为600~700nm的分光光度计测定。当应用浑浊度测量细胞重量时，很重要的一点是发酵产物和培养基的成分不能吸收在所用的波长范围内的光。如果在培养中有许多非细胞固体存在，那么这种技术是不能用的，除非预先除去非细胞颗粒（如家稀盐酸除去CaCO3）。当浑浊度用于估算菌丝体微生物时，在分析之前必须将样品捣碎均匀。
（五）干重测定法
　　1．单细胞微生物的测定
　　细胞培养液经离心洗涤后转移到适当的容器内（尽量轻些的容器为好），分别在100~105℃干燥箱干燥、低温低压干燥（40~80℃）或红外线适温干燥后称重。
　　2．多细胞微生物的测定
　　将菌种接到液体培养基内做震荡培养，经一段时间后，过滤收集菌丝，洗涤后，将菌丝置于80~100℃烘箱中烘干到恒重，或在低温（60℃）下减压干燥后测菌丝量。在固体培养基上，当培养的菌丝生长到一定阶段后，亦可经短时高压灭菌，使琼脂溶化，折出菌丝，用热蒸馏水洗净，再烘干测干重。高压灭菌可能会影响菌丝内某些物质的含量，需要适当控制时间和温度。这样所得到的结果还是相当准确的。
（六）菌丝长度测定法
　　通常以菌丝生长的长度或菌丝增加的重量作为丝状真菌生长的指标。在固体培养基上培养丝状真菌时，以测量菌丝生长长度为主。最简单的方法是将丝状真菌接种在玻璃培养皿内固体培养基的中央，在一定时间内测定菌落的直径或面积。对生长速度快的丝状真菌，可以每24小时测量一次；对生长缓慢的丝状真菌，可数日测量一次，直到菌落掩盖全皿为止。由此可求出菌丝的平均生长速度。据此绘制生长曲线。
　　这种方法的缺点是仅能测菌落的直径或面积，而不能测量菌落的厚度和生长在培养基内的菌丝量，因而不能反映菌丝的总量。
　　另一个计算丝状真菌生长率的方法为载玻片培养法(图3-15)。

图3-15　载玻片培养法
（七）细胞堆积体积的测法
　　把细胞悬浊液装在毛细沉淀管或刻度离心菅中，在一定条件下进行离心，根据收集的沉淀体积计算出菌量。用这个方法时，因为除细胞本身的体积外，细胞与细胞之间的空间体积也包括在内，所以通常不规则的菌丝难以采用这种方法。
　　工厂测定细胞重量常用的方法是测定细胞堆积体积。

图3-16　刻度离心菅
(八) 膜过滤培养计数法
　　将细胞浓度很稀的一定体积的待测液通过一定孔径膜的吸滤装置，然后放在平皿培养基上培养，就可获得活细胞数（图3-17）。

图3-17　微生物膜过滤装置

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四、营养物质的浓度及性质对微生物生长速率的影响
　　在典型的分批发酵（单细胞裂殖微生物细菌的分批培养）中，微生物在对数期的比生长速率μ是个常数，它与营养浓度的改变无关。但是生长速率（dX/dt）就象化学反应速率一样是化学组成浓度的函数。
即：　　dX/dt=μX
　　在这种情况下，这些化学组分就是基础营养或限制性基质。由前述，Monod公式可知，生长速率与限制性基质浓度之间的关系经验表达式为：
μ=μmax S/KS+S
式中 μ——生长速率
μmax—— 在指定温度和pH条件下的最大比生长速率，即在过量营养条件下达到的比生长速率
S——限制性基质的浓度
KS——当比生长速率为最大比生长速率一半时限制基质的浓度
KS值与微生物对该基质的亲和力成反比。一般来讲，多数生长基质的KS值是很小的，如糖是2~20μM，氨基酸是2μM。同一种基质对不同的微生物的KS也不同。这意味着在正常的分批培养中，直到生长结束比生长速率都接近μmax.
　　当S＞10KS时，μ≈μmax；当S＜10KS时，比生长速率为基质浓度的函数。因为KS一般都很小，所以在对数期微生物的比生长速率是恒定的。从对数期到稳定期的过渡通常是十分迅速或突然的。因为从这一点以后剩余基质的浓度就很低了，高浓度的细胞很快地利用残留的基质。
　　Monod模型虽属于经验观察，但它与米氏（Michaelis-Menton）酶动力学模型相似，并且可以假设单一限制速率的酶所催化的步骤控制着生长速率，因而可以认为它是合乎道理的。
　　某些单一的碳源与其它碳源相比，能使细胞维持比较高的生长速率。这表明每种化合物能以不同的程度供给细胞主要反应所需要的能量和生产所需要的碳代谢物。增加培养物能够利用的基质的数量（如添加氨基酸混合物），可使细胞生长速率进一步上升。这是因为微生物使用事先合成的前体（指蛋白质等），可省下前体合成所需要的能量，并使这些能量转用到细胞生长上去。如营养吸收，核酸、蛋白质、膜、细胞壁等的合成。因此，实验室经常采用改变培养基营养成分的方法来获得不同的细胞生长速率。

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五、多种碳源及复合培养基存在下的微生物的生长
　　图3-10所示的生长曲线代表微生物在单一碳源和能源培养基中的生长模型。当有一种以上的碳源和能源同时存在时，通常在一段时间内仅有一种碳基质首先被微生物所利用。菌体的生长速度与这种碳源的性质密切相关，一些微生物在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长，会产生“二次生长”。葡萄糖首先被利用，用完才使分解乳糖的酶解担遏，从而开始利用乳糖。
　　因此培养基中许多碳基质同时存在，则将得到一系列生长阶段（不止二次生长）。若在一种复合的培养基中，不仅有多种碳源，而且有各种各样的化合物如氨基酸、核苷酸、维生素类和其它代谢中间物，那么在生长过程中，这些细胞的酶体系要经过多次变化。当细胞在已加入中间物的培养条件下生长时，细胞就不会合成形成这些中间物的酶系统。只有等这种中间物用完后，才会合成该酶系统。因此，如果在复合培养基中生长，细胞连续地耗尽有用的中间物，则随着时间的推移，需要合成的酶系统就越来越多。当预先加入的中间物和最易利用的营养耗尽后，生长速率就回降低。
　　实际生产中均使用复合培养基。微生物在复合培养基中的二次生长曲线如图3-18所示。

图3-18 复合培养基中的二次生长曲线
　　在这里细胞不是呈现指数生长。事实上曲线是由一系列指数曲线所组成的，只是其斜率不断随时增加而减小罢了。这种形式的生长和产物形成曲线，在用复合培养基进行的工业发酵生产中是最常见的。

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第三节　培养基选择和配制的原则
　　培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要的影响。微生物的营养活动是依靠向外界分泌大量的酶，将周围环境中大分子蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，借助于细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养物质来实现的。不同的微生物的生长情况不同或合成不同的发酵产物时所需的培养基有所不同，但对于所有发酵生产用培养基的设计仍存在某些共同点可供遵循，这就是所有的发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。

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1、培养基的选择

　　不同的微生物对培养基的需求是不同的，因此，不同微生物培养过程对原料的要求也是不一样的。应根据具体情况，从微生物营养要求的特点和生产工艺的要求出发，选择合适的营养基，使之既能满足微生物生长的需要，又能获得高产的产品，同时也要符合增产节约、因地制宜的原则。
　　⒈ 根据微生物的特点选择培养基
　　用于大规模培养的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等四大类。它们对营养物质的要求不尽相同，有共性也有各自的特性。在实际应用时，要依据微生物的不同特性，来考虑培养基的组成，对典型的培养基配方需作必要的调整。
　　⒉ 根据发酵方式选择培养基
　　液体和固体培养基各有用途，也各有优缺点。在液体培养基中，营养物质是以溶质状态溶解于水中，这样微生物就能更充分接触和利用营养物质，更有利于微生物的生长和更好地积累代谢产物。工业上，利用液体培养基进行的深层发酵具有发酵效率高，操作方便，便于机械化、自动化，降低劳动强度，占地面积小，产量高等优点。所以发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行发酵，并根据微生物对氧的需求，分别作静止或通风培养。而固体培养基则常用于微生物菌种的保藏、分离、菌落特征鉴定、活细胞数测定等方面。此外，工业上也常用一些固体原料，如小米、大米、麸皮、马铃薯等直接制作成斜面或茄子瓶来培养霉菌、放线菌。
　　⒊ 从生产实践和科学试验的不同要求选择
　　生产过程中，由于菌种的保藏、种子的扩大培养到发酵生产等各个阶段的目的和要求不同，因此，所选择的培养基成分配比也应该有所区别。一般来说，种子培养基主要是供微生物菌体的生长和大量增殖。为了在较短的时间内获得数量较多的强壮的种子细胞，种子培养基要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应较高，所用的原料也应是易于被微生物菌体吸收利用。常用葡萄糖、硫酸铵、尿素、玉米浆、酵母膏、麦芽汁、米曲汁等作为原料配制培养基。而发酵培养基除需要维持微生物菌体的正常生长外，主要是要求合成预定的发酵产物，所以，发酵培养基碳源物质的含量往往要高于种子培养基。当然，如果产物是含氮物质，应相应地增加氮源的供应量。除此之外，发酵培养基还应考虑便于发酵操作以及不影响产物的提取分离和产品的质量。
　　⒋ 从经济效益方面考虑选择生产原料
　　从科学的角度出发，培养基的经济性通常是不被那么重视，而对于生产过程来讲，由于配制发酵培养基的原料大多是粮食、油脂、蛋白质等，且工业发酵消耗原料量大，因此，在工业发酵中选择培养基原料时，除了必须考虑容易被微生物利用并满足生产工艺的要求外，还应考虑到经济效益，必须以价廉、来源丰富、运输方便、就地取材以及没有毒性等为原则选择原料。

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2、培养基的配制原则

　　培养基的配制必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；有利于减少培养基原料的单耗，单位营养物质所合成产物数量大或产率大；有利于提高培养基产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力；有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期；尽量减少副产物的形成；减少对发酵过程中通气搅拌的影响，有利于提高氧的利用率、降低能耗；有利于产品的分离和纯化；并尽可能减少产生“三废”的物质。
　　当然，设计任何一种培养基都不可能面面俱到地满足上述各项要求，需根据具体情况，抓主要环节。使其即满足微生物的营养要求，又能获得优质高产的产品，同时也符合增产节约、因地制宜的原则。发酵培养基的主要作用是为了获得预期的产物，必须根据产物特点来设计培养基。因此要求营养要适当丰富和完备，菌体迅速生长和健壮，整个代谢过程pH值适当且稳定；糖、氮代谢能完全符合高单位罐、批的要求，能充分发挥生产菌种合成代谢产物的能力。此外还要求成本降低。
　　⒈ 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基
　　不同的微生物所需要的培养基成分是不同的，要确定一个合适的培养基，就需要了解生产用菌种的来源、生理生化特性和一般的营养要求，根据不同生产菌种的培养条件、生物合成的代谢途径、代谢产物的化学性质等确定培养基。
　　⒉ 营养成分的恰当配比
　　微生物所需的营养物质之间应有适当的比例，培养基中的碳氮的比例(C／N)在发酵工业中尤其重要。不同的微生物菌种、不同的发酵产物所要求的碳氮比是不同的。菌体在不同生长阶段，对其碳氮比的最适要求也不一样。培养基的碳氮比不仅会影响微生物菌体的生长，同时也会影响到发酵的代谢途径。由于碳既作碳架又作能源，所以用量要比氮多。从元素分析来看，酵母细胞中碳氮比约为100:20，霉菌约为100:10。一般发酵工业中培养基碳氮比约为100: (0.2～2.0)，但在氨基酸发酵中，因为产物中含有氮，所以碳氮比就相对高一些。如谷氨酸发酵的碳氮比为100: (15～21)，若碳氮比为100: (0.2～2.0)，则会出现只长菌体，几乎不产谷氨酸的现象。
　　碳氮比随碳水化合物及氮源的种类以及通气搅拌等条件而异，很难确定统一的比值。一般情况下，碳氮比偏小，能导致菌体的旺盛生长，易造成菌体提前衰老自溶，影响产物的积累；碳氮比过大，菌体繁殖数量少，不利于产物的积累；碳氮比较合适，但碳源、氮源浓度高，仍能导致菌体的大量繁殖，增大发酵液粘度，影响溶解氧浓度，容易引起菌体的代谢异常，影响产物合成；碳氮比较合适，但碳源、氮源浓度过低，会影响菌体的繁殖，同样不利于产物的积累。
　　⒊ 渗透压
　　配制培养基时，应注意营养物质要有合适的浓度。营养物质的浓度太低，不仅不能满足微生物生长对营养物质的需求，而且也不利于提高发酵产物的产量和提高设备的利用率。但是，培养基中营养物质的浓度过高时，由于培养基溶液的渗透压太大，会抑制微生物的生长。此外培养基中的各种离子的浓度比例也会影响到培养基的渗透压和微生物的代谢活动，因此，培养基中各种离子的比例需求要平衡。在发酵生产过程中，在不影响微生物的生理特性和代谢转化率的情况下，通常趋向在较高浓度下进行发酵，以提高产物产量，并尽可能选育高渗透压的生产菌株。当然，培养基浓度太大会使培养基黏度增加和溶氧量降低。
　　⒋ pH值
　　各种微生物的正常生长均需要有合适的pH值，一般霉菌和酵母菌比较适于微酸性环境，放线菌和细菌适于中性或微碱性环境。为此，当培养基配制好后，若pH值不合适，必须加以调节。当微生物在培养过程中改变培养基的pH值而不利于本身的生长时，应以微生物菌体对各种营养成分的利用速度来考虑培养基的组成，同时加入缓冲剂，以调节培养液的pH值。
　　⒌ 氧化还原电位
　　对大多数微生物来说，培养基的氧化还原电位一般对其生长的影响不大，即适合它们生长的氧化还原电位范围较广。但对于厌氧菌，由于氧的存在对其有毒害作用，因而往往在培养基中加入还原剂以降低氧化还原电位。
　　在配制培养基时，除应注意以上几条原则外，还要考虑到营养成分的加入顺序，为了避免生成沉淀而造成营养成分的损失，加入的顺序一般为先加入缓冲化合物，溶解后加入主要物质，然后加入维生素、氨基酸等生长素类的物质

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3、培养基成分配比的选择

　　培养基的组分(包括这些组分的来源和加入方法)、配比、缓冲能力、黏度、灭菌是否彻底、灭菌后营养破坏的程度及原料中杂质的含量都对菌体生长和产物形成有影响。目前还只能在生物化学、细胞生物学等的基本理论指导下，参照前人所使用的较适合于某一类菌种的培养基（常称为基础培养基）的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶等小型发酵设备，对碳、氮、无机盐和前体等进行逐个单因子试验，观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响，最后再综合考虑各因素的影响，得到一个适合该菌种的培养基的配方，在大规模生产中进行必要的调整，以获得高产。
　　为了减少实验次数，可考虑用“正交试验设计”等数学方法来确定培养基组分和浓度，它可以通过比较少的实验次数而得到较满意的结果，另外，还可通过方差分析，了解哪些因素影响较大，以引起人们的注意。
　　需要注意的是考虑碳源、氮源时，要注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合，发挥各自优势，避其所短，选用适当的碳氮比（C/N）。氮源过多，则菌体繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。碳源过多，则容易形成较低的pH值；碳源不足，菌体衰老和自溶。在考虑培养基所用的有机氮源时，要特别注意原料的来源、加入方法和有效成分的含量。制备培养基时，也应该考虑水分含量。
　　另外还要注意生理酸、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配，根据该菌种在现有工艺设备的条件下，其生长和合成产物时pH值的变化情况，以及最适pH值所控制范围等，综合考虑选用什么生理酸、碱性物质及用量，从而保证在整个发酵过程中pH值都能维持在最佳状态。有时考虑用中间补料来控制pH值。凡是代谢后能产生酸性物质的营养成分叫生理酸性物质，如硫酸铵。凡是代谢后能产生碱性物质的营养成分叫生理碱性物质，如硝酸盐、乙酸钠等。

　　培养基各成分用量的多少，大部分是根据经验而来。但有些初级代谢产物因为它们的代谢途径较清楚，所以根据物料平衡计算来加以确定。如酒精发酵，100 kg淀粉理论上可以产酒精的数量为：

　　对于次级代谢产物，生物合成途径了解有限，根据化学计算比较困难，但也有人根据物料平衡计算了碳源转化为青霉素的得率。Cooney根据化学反应计量关系和经验数据得出下式：

　　上式计算青霉素G的理论得率为每克葡萄糖得1.1 g青霉素G。在确定培养基中碳源数量时，还要考虑用于菌体生长和维持所需的消耗。
　　培养基在大规模生产中用量很大，在选用时应尽量地利用较丰富的廉价原料，设法降低成本。例如，赖氨酸(Lys)生产中先选用山芋淀粉，后改为用山芋粉为碳源，这样不仅价廉，而且山芋粉中还含有生物素、镁盐等，省去了原来所加的玉米浆、硫酸镁，并使整个成本降低15％。