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生态无极

① 初级代谢产物高产菌株的筛选。根据代谢调控的机理，氨基酸、核苷酸、维生素等小分子初级代谢产物的合成途径中普遍存在着反馈阻遏或反馈抑制，这对于生产菌本身是有意义的，因为可以避免合成过多的代谢物而造成能量的浪费。
表4-2　反馈阻遏与反馈抑制的比较

　　酶活性的抑制包括竞争性抑制和反馈抑制。反馈抑制是指反应途径中某些中间产物或末端产物对该途径中前面反应的影响。凡使反应加速的称为正反馈，凡使反应减速的称为负反馈。酶活性的调节机制可用Monod提出的变构酶学说予以说明。
末端产物的反馈抑制普遍存在于合成途径。有两种似上的末端产物的分支代谢途径的反馈抑制，作用机制较复杂，其调节方式见图4-4。

图4-4　反馈抑制模式图

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⒈ 出发菌株的选择
　　工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株(parent strain)。在许多情况下，微生物的遗传物质具有抗诱变性，这类遗传性质稳定的菌株用来生产是有益的，但作为诱变育种材料是不适宜的。出发菌株通常有三种：① 从自然界分离得到的野生型菌株；② 通过生产选育，即由自发突变经筛选得到的高产菌株；③ 已经诱变过的菌株，这类菌株作为出发菌株较为复杂。一般认为诱变获得高产菌株，再诱变易产生负突变，再度提高产量比较困难。采用连续诱变的方法，在每次诱变之后选出3～5株较好的菌株继续诱变，如果遇到高产菌株再诱变进一步提高产量效果不佳时，可以先行杂交，再作为诱变的出发菌株，这样有可能收到比较好的效果。
　　⒉ 菌悬液的制备
　　采用生理状态一致(用选择法或诱导法使微生物同步生长)的单细胞或孢子进行诱变处理，这样不但能均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象的发生。处理前细胞尽可能达到同步生长状态，细胞悬液经玻璃珠振荡打散，并用脱脂棉或滤纸过滤，以达到单细胞状态。
一般处理细菌的营养细胞，采用生长旺盛的对数期，其变异率较高且重现性好。霉菌的菌株一般是多核的，因此对霉菌都用孢子悬浮液进行诱变，对放线菌一般也如此。但孢子生理活性处于休眠状态，诱变时不及营养细胞好，因此最好采用刚刚成熟时的孢子，其变异率高。或在处理前将孢子培养数小时，使其脱离静止状态，则诱变率也会增加。
　　一般处理真菌的孢子或酵母时，其菌悬液的浓度大约为106个／mL，细菌和放线菌的孢子的浓度大约为108个／mL。
　　⒊ 前培养
　　诱变处理前，将细胞在添加嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养20～60 min，再进行诱变处理，则变异率可大幅度提高。
　　⒋ 诱变
　　能诱发基因突变并使突变率提高到超过自然突变水平的物理化学因子都称为诱变剂。可分为物理诱变剂和化学诱变剂两大类。
　　⒌ 变异菌株的分离和筛选
　　通过诱变处理，在微生物群体中出现各种突变型的个体，但其中多数是负突变体。为在短时间内获得好的效果，应采用效率较高的筛选方案或筛选方法。实际工作中，一般分初筛和复筛两阶段进行，前者以量为主，后者以质为主。

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诱变育种方案设计

　　诱变育种一般采用物理、化学诱变因素使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误DNA模板形成异常的遗传信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞功能发生改变。诱变育种不仅可以提高菌株的生产能力，而且还可以改进产品的质量，扩大品种，简化工艺。在科学实验和生产上都得到了广泛应用。目前应用于工业化的生产菌几乎毫无例外地都是经过诱变的改良菌种。
　　按照生产的要求，根据生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选，而达到菌种选育的目的。即就是通过诱变改善菌种的特性，获得优良菌株。
诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。这些环节是相互联系，缺一不可的。在诱变育种的早期阶段，工作一般是顺利的，高产突变株不断涌现。但经过长期诱变得到的高产突变株，再进一步提高时，进展逐渐变慢，困难也越来越多。因此，应在早期周密地设计一个选育工作方案。
　　诱发突变有可能出现多种多样变异性突变株。除了高产性状外，还要考虑其他有利性状。例如，生长速度快、产孢子多；消除某些色素或无益组分；能有效利用廉价发酵原材料；改善发酵工艺中某些缺陷(如泡沫过多、对温度波动敏感、菌丝量太多、自溶早、过滤困难等)。但是所定的筛选目标不可太多，要充分估计人力、物力和测试能力等，要考虑实现这些目标的可能性。要选出一个达到一定产量的高产菌株，往往要筛选数千个左右的突变株，经历多次诱变和筛选，才能达到目的。

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㈠ 突变的诱发
　　诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。例如紫外线照射形成的胸腺嘧啶二聚体就是一种前突变。前突变可以通过影响DNA复制而成为真正的突变，也可以经过修复重新回到原有的结构，即不发生突变。许多环境因素可以影响突变的诱发过程，从而影响突变率。以下将讨论从诱变剂进入细胞到突变型出现的整个过程以及影响这一过程的一些因素。
　　⒈ 诱变剂接触DNA分子
　　诱变剂要进入细胞才能诱发突变，因此细胞对诱变剂的透性将影响诱变结果。诱变剂在接触DNA之前要经过细胞质，细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相互作用而影响诱变效果。
　　突变的诱发还和基因所处的状态有关，而基因的状态又和培养条件有关。在培养基中加入诱导剂使基因处于转录状态，可能有利于诱变剂的作用。据认为在转录时，DNA双链解开更有利于诱变作用。
　　⒉ DNA损伤的修复
　　DNA损伤的修复和基因突变有着密切的关系。已发现微生物有五种修复DNA损伤方式，它们是：光复活作用、切补修复、重组修复、SOS修复系统、DNA多聚酶的校正作用。

图4-2　三种DNA修复作用
　　⑴ 光复活作用　人们发现某些经紫外线照射过的放线菌孢子，如果在可见光下培养时，存活数明显大于在黑暗中培养的同一样品。经研究证明这是有一种为可见光所激活的酶在起作用。这种酶能和经紫外线照射过的DNA在黑暗中结合，形成的复合物置于可见光下，酶和DNA解离，解离下来的DNA分子中不再存在原来的胸腺嘧啶二聚体。见图4-2(a)。
　　⑵ 切补修复　切补修复是在四种酶的协同作用下进行DNA损伤修复，这四种酶都不需要可见光的激活。首先在胸腺嘧啶二聚体5’端，在核酸内切酶的作用下造成单链断裂；其次在核酸外切酶的作用下切除胸腺嘧啶二聚体；然后在DNA多聚酶Ⅰ、Ⅲ的作用下进行修补合成；最后在DNA连接酶的作用下形成一个完整的双链结构。见图4-2 (b)。
　　⑶ 重组修复　重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行，所以又称为复制后修复。重组修复是在不切除胸腺嘧啶二聚体的情况下进行修复作用。以带有二聚体的单链为模板合成互补单链，可是在每一个二聚体附近留下一个空隙。一般认为通过染色体交换，空隙部位就不再面对着二聚体，而是面对着正常的单链，在这种情况下，DNA多聚酶和连接酶就能把空隙部位修复好。见图4-2 (c)。
　　⑷ SOS修复系统　这是一种能够造成误差修复的“呼救信号”修复系统。当DNA受到诱变剂损伤而阻断DNA复制过程时，DNA损伤相当于一个呼救信号，促使细胞中的有关酶系解除阻遏，而进行DNA的修复。在修复过程中，DNA多聚酶在无模板的情况下进行DNA的修复合成，并将合成的DNA片段插入受损DNA的空隙处。SOS修复系统的修复作用容易导致基因突变，大多数经诱变所获得的突变来源于此修复系统的作用。
　　⑸ DNA多聚酶的校正作用　除了上述种种修复作用以外，细胞还具有对复制过程中出现差错加以校正的功能。大肠杆菌中DNA的复制依赖于三种DNA多聚酶(多聚酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的作用，这三种酶除了对于多核苷酸的多聚作用以外，还具有3’到5’核酸外切酶的作用。一般认为依靠DNA多聚酶的这一作用，能在复制过程中随时切除不正常的核苷酸。如果DNA多聚酶发生突变而使其核酸外切酶活性减弱，那么，它切除不正常核苷酸的能力减弱，菌体的突变率相应地提高，成为增变突变型。DNA多聚酶为DNA修复作用所必需，所以增变突变型对于诱变剂的作用格外敏感。

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⒊ 从前突变到突变
　　前突变形成后，细胞中几种修复系统就会对它施加作用。从对突变诱发的影响看，修复系统可以分为校正差错和引起差错这两类。一般认为光复活作用、切补修复和DNA多聚酶校正作用这三种修复作用具有校正差错的性质而不利于突变的诱发，而重组修复和SOS修复系统这两种修复作用具有引起差错的性质而有利于突变的发生。
　　可以认为，一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由前突变到突变这一过程。例如，咖啡碱能抑制切补修复系统，因而增强诱变作用；氯霉素能抑制细菌的蛋白质合成，从而抑制了依赖于蛋白质合成的SOS修复系统和重组修复，降低诱变率。相反地，一切有利于蛋白质合成的因素都有利于提高突变率。
　　与突变有关的一些酶的激活剂或抑制剂也会影响突变率。Ba2+对DNA多聚酶的3’核酸外切酶活性有抑制作用，从而可提高突变率。
　　从上述可以看出，诱变前后的处理可影响诱变的效果。其原因主要有两方面：一是通过影响与DNA修复作用有关的酶活性而影响诱变的效果；二是通过使诱变的目的基因处于活化状态(复制或转录状态)，使之更容易被诱变剂所作用，从而影响目的基因的突变率。

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⒋ 从突变到突变表型
　　突变基因的出现并不等于突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型迟延。表型迟延有两种原因：分离性迟延和生理性迟延。
　　⑴ 分离性迟延　分离性迟延实际上是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态(野生型的基因和突变型的基因并存于同一细胞中)，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态(一细胞中只有突变型基因，没有野生型基因)时，其性状才得以表达。
　　大肠杆菌在对数生长期含有2～4个核质体，当其中一个核发生突变时，这个细胞变成异核体。如果突变表型表现为某个基因所控制的产物的丧失，那么这一突变在异核体内就是隐性的。因为其他的核继续生产该基因控制的产物。需要经历1～2个世代，通过细胞分裂而出现同一细胞的所有核中都带有这一突变基因时，突变表型才出现。
　　⑵ 生理性迟延　突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。而这些原有基因产物的浓度降低到能改变表型的临界水平以前，细胞已经分裂多次，经过了好几个世代。例如某个产酶基因发生了突变，可是细胞中原有的酶仍在起作用，细胞所表现的仍是野生型表型。只有通过细胞分裂，原有的酶已经足够稀释或失去活性时，才出现突变型的表型。生理性迟延最明显的例子是噬菌体抗性突变的表达。用诱变剂处理噬菌体敏感菌，将存活菌体立即分离在含噬菌体的培养基上，其抗性菌株不立即出现。而将存活菌先在不含噬菌体的培养基中繁殖几代后，再分离后接到含有噬菌体的培养基中，则可得到大量抗性菌。有些诱发突变要经历十几个世代才能表达。敏感菌对某一些噬菌体敏感是因为其细胞表面具有该噬菌体的受体，抗性菌因不产生该受体而对噬菌体具有抗性。但是基因发生了抗性突变而细胞表面具有受体的细胞仍会受到噬菌体的感染，抗性突变的表型必须等到经过多次细胞分离，细胞表面不再存在有受体时才能表现出来。

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㈡ 诱变剂的种类及选择
　　⒈ 诱变剂
　　物理诱变剂主要为各种射线，如紫外线、X射线、α射线、β射线、γ射线和超声波等，其中以紫外线应用最广，紫外光谱作用光谱正好与细胞内的核酸的吸收光谱相一致，因此在紫外光的作用下能使DNA链断裂、DNA分子内和分子间发生交联形成嘧啶二聚体，从而导致菌体的遗传性状发生改变。
　　化学诱变剂的种类较多，常用的有甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。它们作用于微生物细胞后，能够特异地与某些基团起作用，即引起物质的原发损伤和细胞代谢方式的改变，失去亲株原有的特性，并建立起新的表型。所谓“表型”是指某一生物个体能够观察到的特殊性状。所谓“基因型（遗传型）”是指某一生物个体所含有的全部遗传因子（即基因组）所携带的遗传信息。
　　诱变剂亚硝基胍和甲基磺酸乙酯虽然诱变效果好，但由于多数引起碱基对转换，得到的变异株回变率高。电离辐射、紫外线和吖啶类等诱变剂，能引起缺失、阅读密码组移动等巨大损伤，则不易产生回复突变。诱变处理剂量的选择是一个比较复杂的问题，一般正突变较多出现在偏低剂量中，而负突变则较多地出现于偏高剂量中。对于经过多次诱变而提高了产量的菌株，在较高剂量负突变率更高。因此，目前处理量已从以前采用的死亡率90％～99％减低为死亡率70％～80％。各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间如表4-1。
表4-1　各种化学诱变剂常用的剂量、处理时间

　　诱变剂的选择主要是根据已经成功的经验，诱变作用不但决定于诱变剂，还与菌种的种类和出发菌株的遗传背景有关。一般对遗传上不稳定的菌株，可采用温和的诱变剂，或采用已见效果的诱变剂；对于遗传上较稳定的菌株则采用强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂。要重视出发菌株的诱变系谱，不应常采用同一种诱变剂反复处理，以防止诱变效应饱和；但也不要频频变换诱变剂，以避免造成菌种的遗传背景复杂，不利于高产菌株的稳定。
　　选择诱变剂时，还应该考虑诱变剂本身的特点。例如紫外线主要作用于DNA分子的嘧啶碱基，而亚硝酸则主要作用于DNA分子的嘌呤碱基。紫外线和亚硝酸复合使用，突变谱宽，诱变效果好。

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(a) 协同反馈抑制　此种抑制作用的特点是分支途径的几种末端产物同时过量时才抑制共同途径中的第一个酶活性。如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)合成天冬氨酸族氨基酸时，天冬氨酸激酶受到赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。
　　(b) 累积反馈抑制　此种抑制作用的特点是每一种末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中第一个酶活性。各种产物间既无协同效应，又无拮抗作用。它们抑制的酶，有的是同功酶(能催化同一种生化反应，但酶分子结构有所不同的一组酶)，有的是多功能酶(指结构上仅为一种多肽，但却具有两种或两种以上催化活力的酶蛋白)。如谷氨酰胺合成酶受到八种末端产物的累积反馈抑制。
　　(c) 增效反馈抑制　其特点是代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同反应途径中的第一个酶活性，但是两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和。此种调节方式发现在6-氨基嘌呤核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸生物合成途径。两类核苷酸各自都能部分地抑制磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶的活性。而6-氨基和6-酮基嘌呤核苷酸混合物(GMP+AMP或AMP+IMP)对该酶有强烈地抑制作用。
　　(d) 顺序反馈抑制　每个分支末端产物抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制作用。如枯草杆菌合成芳香族氨基酸时的反馈抑制作用。
但是，在工业生产中，需要生产菌产生大量的氨基酸、核苷酸、维生素等产物。因此，需要打破微生物原有的反馈调节系统。育种工作要达到此目的，可从以下两个方面着手。
　　Ⅰ 降低终产物浓度
　　(a) 筛选终产物营养缺陷型　如图4-5所示。在图4-5中，假设所需要的发酵产物是C，而该生物合成途径的终产物是E，则可筛选E的营养缺陷型；如果营养缺陷型是由C→D的代谢被阻断，则可解除终产物E对发酵产物C合成的反馈阻遏或反馈抑制，而积累大量的发酵产物C。

图4-5　在简单的代谢途径中积累中间产物

图4-6　赖氨酸的大量生成
　　实例见图4-6。在谷氨酸棒杆菌的原始菌株中，赖氨酸和苏氨酸协同反馈抑制天冬氨酸激酶，获得了一个缺少高丝氨酸脱氢酶的突变株。它的生长需要苏氨酸和蛋氨酸。如果苏氨酸以限制生长的浓度加入时，协同反馈抑制被打破而大量产生赖氨酸，谷氨酸棒杆菌的双氢吡啶二羧酸合成酶对赖氨酸的反馈抑制不敏感。
　　总之，筛选终产物营养缺陷型适合于下面三种情况：发酵产物为某一直线合成途径的中间产物如图4-5所示；发酵产物为某一分枝合成途径的中间产物；发酵产物为某一分枝合成途径的一个终产物时，可筛选该分枝合成途径的另一终产物的营养缺陷型，如图4-6所示。
　　(b) 筛选细胞膜透性改变的突变株　使之大量分泌排出终产物，以降低细胞内终产物浓度，从而避免终产物反馈调节。例如，用谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型(biotin deficiency)进行谷氨酸发酵，生物素是合成脂肪酸所必需的，而脂肪酸又是组成细胞膜类脂的必要成分。该缺陷型在生物素处于限量的情况下，不利于脂肪酸的合成，因而使细胞膜的渗透性发生变化，有利于将谷氨酸透过细胞膜分泌至胞外的发酵液中。如果使用油酸缺陷型菌株或者甘油缺陷型菌株，即使在生物素过量的条件下，也可使谷氨酸在胞外大量积累。

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Ⅱ 筛选抗反馈突变菌株
　　(a) 筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株　分离抗反馈突变株的最常用的方法是用与代谢产物结构类似的化合物(结构类似物)处理微生物细胞群体，杀死或抑制绝大多数细胞，选出能大量产生该代谢物的抗反馈突变株。结构类似物一方面具有和代谢物相似的结构，因而具有和代谢物相似的反馈调节作用，阻碍该代谢物的生成；另一方面它不同于代谢物，不具有正常的生理功能，对细胞的正常代谢有阻碍作用，会抑制菌的生长或导致菌的死亡。例如，一种氨基酸终产物，在正常的情况下，参与蛋白质合成，过量时可抑制或阻遏它自身的合成酶类。如果这种氨基酸的结构类似物也显示这种抑制或阻遏，但却不能用于蛋白质的合成，那么当用这种结构类似物处理菌株时，大多数细胞将由于缺少该种氨基酸而不能生长或者死亡，而那些对该结构类似物不敏感的突变株，仍然能够合成该种氨基酸而继续生长。某些菌株所以能抵抗这种结构类似物，是因为被该氨基酸(或结构类似物)反馈抑制的酶的结构发生了改变(抗反馈抑制)，或者被阻遏的酶的生成系统发生了改变(抗反馈阻遏)。由于突破了原有的反馈调节系统，这些突变株就可产生大量的该种氨基酸。
　　例如选育L-精氨酸（L-Arg）高产菌株，可采用筛选结构类似物D-Argr菌株的方法（一般文献中采用上标“r”表示抗性，“s”表示敏感型）。
　　(b) 利用回复突变筛选抗反馈突变菌株　经诱变处理出发菌株，先选出对产物敏感的营养缺陷型，再将营养缺陷型进行第二次诱变处理得到回复突变株。筛选的目的不是要获得完全恢复原有状态的回复突变株，而是希望经过两次诱发突变，所得的回复突变株有可能改变了产物合成酶的调节部位的氨基酸的顺序，使之不能和产物结合，因而不受产物的反馈抑制。例如，谷氨酸棒杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了鸟苷酸的产量。

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② 次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选。次级代谢是某些生物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，次级代谢产物的合成同时还受到核外遗传物质——质粒的控制，有人将这种代谢产物叫做质粒产物。次级代谢有不同于初级代谢的特点，因此其筛选方法也和初级代谢略有不同。次级代谢产物不是菌体生长、繁殖所必需的，往往不能简单地采用筛选营养缺陷型或结构类似物抗性菌株的方法来获得高产菌株。
　　次级代谢又受到初级代谢的调节，次级代谢和初级代谢有一些共同的中间产物，这些中间产物可以进而合成初级代谢产物，也可以进而合成次级代谢产物，这取决于菌的遗传特性和生理状态，这些中间产物叫做分叉中间体。微生物的代谢调节系统趋向于平衡地利用营养物质，当环境中某些营养物质过剩，而某些营养物质缺乏时，菌体不能有效的摄入营养，在代谢调节系统作用下，菌的生长繁殖速率下降，并通过代谢途径的改变将过剩的营养物质转变成与生长繁殖无关的次级代谢产物。因此，可筛选某些营养缺陷型或初级代谢产物结构类似物抗性菌株以消除初级代谢产物对那些共同中间产物的反馈调节，使之大量积累而有利于次级代谢产物的合成。大多数菌株在被快速利用的碳、氮、磷源消耗至一定程度时才产生有活性的次级代谢酶，因此筛选解除分解代谢调节突变株，可以获得高产菌。