[分享]食用菌菌种质量检测技术

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 农业部根据《种子法》制定的《食用菌菌种管理办法》，于2006年6月1日起施行．该办法从菌种场资质、生产经营到行政管理等方面对菌种质量要求都有十分明确的规定。但如何检测菌种质量．目前尚未统一检测技术，为贯彻实施《食用菌菌种管理办法》，笔者从多年的生产实践与管理过程中总结了一套菌种质量检测技术。现将该技术介绍如下：

1种性检测

种性是指食用菌品种特性的简称．它由形态特征、生物学特性和农艺性状三个方面组成的．其检测内容分为形态学检测、生物学特性检测和农艺性状检测。同时，随着现代生物技术的发展．利用遗传学、同工酶和DNA指纹检测等技术也可以作为种性检测的重要手段。

1．1形态学检测

1．1．1菌落特征观察  取待检菌种(母种、原种或栽培种，下同)通过转管活化后，再接种于平板培养基上．适温培养至菌落直径为培养皿直径的2／3时，观察菌落形态，主要包括菌落大小、气生菌丝和厚垣孢子等内容。同时，将该品种的标准菌株的菌种(以下简称标准菌种)设为对照，做同样处理，对比二者的菌落形态。如果菌落特征有差异．表明是不同品种；如果菌落特征没有差异．还不能判断是同一个品种。

1．1．2拮抗试验取待检菌种和标准菌种分别进行转管活化。在一个平板培养基上相距3era左右接种。适温下培养。待两个菌落交接时进行观察。如果交接处出现明显的线状特征(有的食用菌出现栅栏状、有的出现不长菌丝的区带)，即为拮抗．表明待检菌种与标准菌种是不同的菌株：如果没有表明出拮抗．待检菌种与标准菌种可能是同一菌株也可能不是．不能判断。

1．1．3菌丝显微观察  在载玻片上滴一滴无菌水．用解剖针从待检菌种活化后试管内挑取少许菌丝于水滴上，撕散菌丝，盖上盖玻片．先用10倍物镜观察，再转到40倍物镜下观察菌丝的细微结构．尤其是判断是否有锁状联合、观察锁状联合的形态特征。测量菌丝细胞的宽度。同时．将该品种的标准菌种设为对照。做同样处理．对比二者的锁状联合的形态特征和细胞的宽度，如果有差异．表明是不同品种。如果二者没有差异．两者可能是同一菌株也可能不是．不能判断。

1．1．4子实体形态特征观察  待检菌种与标准菌种在同样条件(相同的培养基、同时接种、同样环境下培养菌丝、同一菇房相近的位置)进行出菇．取各种发育阶段的子实体，肉眼观察其菌盖、菌褶、菌柄、菌环、菌托的形态特征、大小、长短、厚薄等。如果有明显差别，可以判断为不同品种。

1．2生物学特性检测

1．2．1温度  取活化的待检菌种与标准菌株．分别接人相同的平板培养基(或斜面培养基)n个．放于适宜的温度下培养．当菌落直径1~2cm时．在菌落边缘画线作为生长起始线。随后把这些培养皿(或试管)分别置于5、10、15、20、25、30、35、40、45℃下培养．当生长最快的温度下的培养皿即将长满时取出，在菌落边缘再画一终止线．用尺子测量起始线与终止线之间的距离．计算菌丝生长速度，即可获得菌丝生长温度范围、最适生长温度。如果菌丝在某一温度下不生长．可以把这些培养皿再放到适宜的温度下培养．即可得出致死温度和限制生长温度(不生长但不死)。

1．2．2湿度取活化的待检菌种接人不同含水量(如45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％)的原种培养基上．置于适宜的温度下培养。当菌丝封面并长人料内2~3cm时．沿着菌丝前端画一条起始生长线后，继续培养，当快长满瓶时．再画一条终止线。用尺子测量起始线与终止线之间的距离．计算菌丝生长速度．即可获得菌丝生长适宜的含水量范围、生长最适含水量。

1．2．3酸碱度取活化的待检菌种接入不同酸碱度(pH1~11)的平板培养基上，置于适宜的温度下培养。当菌落直径1~2cm时．在菌落边缘画线作为生长起始线，继续培养，当快长满皿时，再画一条终止线。用尺子测量起始线与终止线之间的距离．计算菌丝生长速度．即可获得菌丝生长适宜的oH范围、生长最适pH。

1．2．4光线取活化的待检菌种接人相同的平板培养基(或斜面培养基)上，分成2份(其中1份用黑布遮光)。放于光照培养箱中。于适宜的温度下培养。当菌落直径1~2cm时．在菌落边缘画线作为生长起始线。继续培养．当快长满皿时，再画一条终止线。用尺子测量起始线与终止线之间的距离．计算菌丝生长速度，观察菌落特征．即可获知光线对菌丝生长的影响。

1．3农艺性状检测

将待检菌种制成母种。再生产为原种。采用该品种适宜的培养基配方．制做袋栽45袋(床栽6m2)。接种后分3组(每组15袋或2m2)进行常规管理。在出菇阶段，作好每天的采收记录(重量、朵数．用于分析各潮菇的出菇时间、产量分布、转潮天数等)，根据表1所列项目，进行适当的统计分析．整理成试验结果。同时将该品种的标准菌株设为对照，做同样处理。对比二者的检验结果，统计分析其差异显著性。

1．4现代生物技术检测

1．4．1遗传学检测  收集待检菌种和标准菌种的担孢子．通常单孢分离获得单孢菌株．品种内单孢菌株之间进行配对．观察是否形成锁状联合．获得各种基因型的单孢菌株。待检菌种和标准菌种的单孢菌株之间进行配对。通过观察是否形成锁状联合．判断两个品种的不亲和性因子的基因型。如果2个品种的不亲和性因子基因型不同．则可以判断它们是两个不同品种。如果其基因型相同．则可能是相同品种也可能是不同品种，不能确定。

1．4．2同工酶检测  从待检菌种的菌丝体中提取的粗酶液经电泳后．进行生物化学染色．同工酶的各组分会显示在凝胶的不同位置而形成同工酶酶谱。相同的菌种遗传背景相同，其同工酶酶谱也相同。常用于品种鉴别的同工酶有：酯酶同工酶、多酚氧化酶同工酶、过氧化物酶同工酶等。

1．4．3 DNA指纹检测  品种之间的种性差异是由于其DNA序列的差异．应用DNA检测技术判断待检菌种与标准菌种的DNA是否有差异．若有．则为两个不同的品种，若没有．则为相同品种。DNA指纹检测的方法很多．但归结起来不外乎寻找可应用于品种鉴别的特异DNA片段．即为分子标记．通过试验．检查两个品种所拥有的各种分子标记是否一样．从而作出判断。

2纯度检测

纯度指菌种的纯化(净)程度．不能混有病毒、细菌、霉菌、螨虫、线虫等。除了用肉眼观察判断外．根据染杂对象不同采用以下相应的检测方法。

2．1病毒检测

主要借鉴植物、动物病毒检测和酶联免疫法。具体做法：提纯待检菌种的病毒，用这种病毒免疫动物(如兔子)，获得抗血清，应用抗原抗体结合的特异性及酶联显色技术进行检测，如果样品中存在病毒，则有颜色显现。

2．2细菌检测

取少量待检菌种．按无菌操作接入营养肉汤培养液中，25~28℃振荡培养1~2d，观察培养液是否混浊。若培养液澄清，可初步判断为无细菌污染；若培养液混浊．可初步判断为为有细菌污染。为了进一步作出准确判断．可把培养液划线接种营养肉汤平板培养基，25-28℃恒温培养1~2d．观察是否有细菌菌落出现。

2．3霉菌检测

2．3．1培养基上霉菌检测  用接种针取少量待检菌种疑有霉菌污染部位．按无菌操作接种于PDA培养基中．25~28℃培养3~4d．出现白色以外色泽的菌落、非待检菌种的菌落或有异味者为霉菌污染物。必要时可用显微观察方法进行观察判断．霉菌一般是低等真菌．没有锁状联合。

2．3．2棉塞上霉菌检测  用酒精灯把露在试管口(或瓶口)外的棉花塞烧弃．用消毒过的镊子夹出剩余的棉塞．用接种针粘取棉塞底部．转入新鲜 PDA斜面培养基．25~28℃培养3~4d后．按2．3．1方法进行判断。

2．4螨虫和线虫检测  用接种针挑取取少许待检菌种的菌丝于载玻片上水滴中．撕散菌丝．盖上盖玻片．用lO倍或40倍物镜观察．检查是否有螨虫或线虫存在。

3活力检测

活力指菌种的生活适应能力和抗逆能力．反映菌种的活力，如菌丝形态、发菌程度、色素、分泌物、菌丝自溶、拮抗线、原基、脱壁等。这些指标都可用肉眼来判断。还可以通过以下试验来检查菌种的活力。

3．1取待检菌种．按无菌操作要求．用接种铲或接种耙铲弃菌种表面(或斜面)一薄层，塞回棉花塞．放于适宜的温度下培养．观察其萌发出新菌丝的能力。

3．2取待检菌种．按无菌操作要求．接入下一级菌种培养基．适宜的温度下培养．观察其萌发出新菌丝及吃料的能力。（作者张金霞）

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菌种检测的方法值得一学，但大都是实验室方法，菇农不会呀。

王茂

菇农肯定不会三。这个检测方法提出来是为了给有从业资格的菌种场用的，也可以给负责菌种管理的部门做个参考。