[推荐]微生物与发酵工艺知识大全

myswang

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第八章　发酵生产染菌及其防治

　　发酵生产过程大多为纯种培养过程，需要在无杂菌污染的条件下进行。发酵生产的环节比较多，尤其是好氧发酵生产，既要连续搅拌和供给无菌空气，又要排放多余空气、多次添加消泡剂、补充培养基、定时取样分析及不断改变空气量供给等，这些操作都给防治发酵生产染菌带来了很大的困难。所谓发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养这一现象。为了防止染菌，人们采取了一系列措施，如改进生产工艺，对发酵罐、管道和其他附属设备、培养基及空气等严格灭菌。对水、无菌空气除严格按无菌要求供应外，还健全了生产技术管理制度，大大降低了生产过程染菌率。但是至今仍无法完全避免染菌的严重威胁，轻者影响了产品的收率和产品质量，重者会导致“倒罐”，造成严重的经济损失。据报道，国外抗生素发酵染菌率为2％～5％，国内的青霉素发酵染菌率2％，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率5％，谷氨酸发酵噬菌体感染率1％～2％。染菌对发酵生产率、提取率、得率、产品质量和三废治理等都有很大的影响。
　　从国内外目前的报道来看，在现有的科学技术条件下要做到完全不染菌是不可能的。目前要做的是要提高生产技术水平，强化生产过程管理，防止发酵染菌的发生。一旦发生染菌，应尽快找出污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。

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第一节 染菌对发酵的影响
　　染菌对发酵过程的影响是很大的，但由于生产的产品不同、污染杂菌的种类和性质不同、染菌发生的时间不同以及染菌的途径和程度不同，染菌造成的危害及后果也不同。

　　一、染菌对不同发酵过程的影响
　　由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。如青霉素的发酵过程，由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。对于核苷或核苷酸的发酵过程，由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。对于柠檬酸等有机酸的发酵过程，一般在产酸后，发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。但是，不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产物的产量大为降低。谷氨酸发酵周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的威胁非常大。

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二、染菌发生的不同时间对发酵的影响
　　从发生染菌的时间来看，染菌可分为种子培养期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染菌和发酵后期染菌等四个不同的染菌时期，不同的染菌时期对发酵所产生的影响也是有区别的。
　　⑴ 种子培养期染菌　种子培养主要是使生产菌生长与繁殖，此时，微生物菌体浓度低，培养基的营养十分丰富，比较容易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
　　⑵ 发酵前期染菌　在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌，染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。
　　⑶ 发酵中期染菌　发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有的染菌后杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速，菌体发生自溶，致使发酵液发黏，产生大量的泡沫，代谢产物的积累减少或停止；有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。从目前的情况来看，发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现，快处理。
　　⑷ 发酵后期染菌　由于在发酵后期，培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。对发酵产物来说，发酵后期染菌对不同的产物的影响也是不同的，如柠檬酸的发酵，染菌对产物的影响不大；抗生素、肌苷酸、谷氨酸、氨基酸等的发酵，后期染菌也会影响产物的产量、提取和产品的质量。

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三、染菌程度对发酵的影响
　　染菌的程度对发酵的影响是很大的。染菌程度愈严重，即进入发酵罐内的杂菌数量愈多，对发酵的危害也就愈大。当生产菌在发酵过程已有大量的繁殖，并已在发酵液中占优势，污染极少量的杂菌，对发酵不会带来太大的影响，因为进入发酵液的杂菌需要有一定的时间才能达到危害发酵的程度，而且此时环境对杂菌繁殖已相当不利。当然如果染菌程度严重时，尤其是在发酵的前期或发酵的中期，对发酵将会产生严重的影响。

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第二节 发酵异常现象及原因分析
　　一、种子培养和发酵的异常现象
　　发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指发酵过程中的某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然影响发酵水平，使生产蒙受损失。对此，应及时查明原因，加以解决。
　　⒈ 种子培养异常
　　种子培养异常表现在培养的种子质量不合格。种子质量差会给发酵带来较大的影响。然而种子内在质量常被忽视，由于种子培养的周期短，可供分析的数据较少，因此种子异常的原因一般较难确定，也使得由种子质量引起的发酵异常原因不易查清。种子培养异常的表现主要有菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化以及培养液的理化参数变化。
　　⑴ 菌体生长缓慢　种子培养过程中菌体数量增长缓慢的原因很多。培养基原料质量下降、菌体老化、灭菌操作失误、供氧不足、培养温度偏高或偏低、酸碱度调节不当等都会引起菌体生长缓慢。此外，接种物冷藏时间长或接种量过低而导致菌体量少，或接种物本身质量差等也都会使菌体数量增长缓慢。
　　⑵ 菌丝结团　在培养过程中有些丝状菌容易产生菌丝团，菌体仅在表面生长，菌丝向四周伸展，而菌丝团的中央结实，使内部菌丝的营养吸收和呼吸受到很大影响，从而不能正常地生长。菌丝结团的原因很多，诸如通气不良或停止搅拌导致溶氧浓度不足；原料质量差或灭菌效果差导致培养基质量下降；接种的孢子或菌丝保藏时间长而菌落数少，培养液泡沫多；罐内装料小、菌丝粘壁等会导致培养液的菌丝浓度比较低；此外，接种物种龄短等也会导致菌体生长缓慢，造成菌丝结团。
　　⑶ 代谢不正常　代谢不正常表现出糖、氨基氮浓度等变化不正常，菌体浓度和代谢产物浓度不正常。造成代谢不正常的原因很复杂，除与接种物质量和培养基质量差有关外，还与培养环境条件差、接种量小、杂菌污染等有关。

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⒉ 发酵异常
　　不同种类的发酵过程所发生的发酵异常现象，形式虽然不尽相同，但均表现出菌体生长速度缓慢、菌体代谢异常或过早老化、耗糖慢、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液颜色的异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的黏度异常增加等。
　　⑴ 菌体生长差　由于种子质量差或种子低温放置时间长导致菌体数量较少、停滞期延长、发酵液内菌体数量增长缓慢、外形不整齐。种子质量不好、菌种的发酵性能差、环境条件差、培养基质量不好、接种量太少等均会引起糖、氮的消耗少或间歇停滞，出现糖、氮代谢缓慢现象。
　　⑵ pH值过高或过低　发酵过程中由于培养基原料质量差、灭菌效果差，加糖、加油（消泡剂）过多或过于集中，将会引起pH值的异常变化。而pH值变化是所有代谢反应的综合反映，在发酵的各个时期都有一定规律，pH值的异常变化就意味着发酵的异常。
　　⑶ 溶氧水平异常　根据发酵过程出现的异常现象如溶氧、pH值、排气中的CO2含量以及微生物菌体酶活力等的异常变化来检查发酵是否染菌。对于特定的发酵过程　　要求一定的溶氧水平，而且在不同的发酵阶段其溶氧的水平也是不同的。如果发酵过程中的溶氧水平发生了异常的变化(参看图7-5)，一般就是发酵染菌的表现。
　　在正常的发酵过程中，发酵初期菌体处于停滞期，耗氧量很少，溶氧基本不变；当菌体进入对数期，耗氧量增加，溶氧浓度很快下降，并且维持在一定的水平，在这阶段中操作条件的变化会使溶氧有所波动，但变化不大；而到了发酵后期，菌体衰老，耗氧量减少，溶氧又再度上升；当感染噬菌体后，生产菌的呼吸作用受抑制，溶氧浓度很快上升。发酵过程感染噬菌体后，溶氧的变化比菌体浓度更灵敏，能更好地预见染菌的发生。
　　由于污染的杂菌好氧性不同，产生溶氧异常的现象也是不同的。当杂菌是好氧性微生物时，溶氧的变化是在较短时间内下降，直到接近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是非好氧性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶氧升高。对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出的气体中CO2含量的变化是规律的。染菌后，培养基中糖的消耗发生变化，引起排气中CO2含量的异常变化，如杂菌污染时，糖耗加快，CO2含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢，CO2含量减少。因此，可根据CO2含量的异常变化来判断是否染菌。
　　⑷ 泡沫过多　一般在发酵过程中泡沫的消长是有一定的规律的。但是，由于菌体生长差、代谢速度慢、接种物嫩或种子未及时移种而过老、蛋白质类胶体物质多等都会使发酵液在不断通气、搅拌下产生大量的泡沫。除此之外，培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖受到破坏后产生的氨基糖会抑制菌体的生长，也会使泡沫大量产生，从而使发酵过程的泡沫发生异常。
　　⑸ 当导致营养条件较差，种子质量差，菌体或菌丝自溶等均会严重影响到培养物的生长，导致发酵液中菌体浓度偏离原有规律，出现异常现象。

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二、染菌的检查和判断
　　发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。因此，生产上要求能准确、迅速的检查出杂菌的污染。目前常用于检查是否染菌的无菌试验方法主要有显微镜检查法、肉汤培养法、平板(双碟)培养法、发酵过程的异常观察法等。
　　⒈ 显微镜检查法(镜检法)
用革兰氏染色法(Grams stain)对样品进行涂片、染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征进行区别、判断是否染菌。如发现有与生产菌形态特征不一样的其他微生物的存在，就可判断为发生了染菌。此法检查杂菌最简单、最直接，也是最常用的检查方法之一。必要时还可进行芽孢染色或鞭毛染色。
　　⒉ 肉汤培养法
　　通常用组成为0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％氯化钠、0.8％蛋白胨、0.4％的酚红溶液(pH7.2，呈红色)的酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的该肉汤培养基中，分别于37 ℃、27 ℃进行培养，每6 h观察一次微生物的生长情况，并取样进行镜检，该肉汤培养基由红色变为黄色或产生浑浊，即判断为染菌。肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体的检查。
　　⒊ 平板划线培养或斜面培养检查法
　　将待检样品在无菌平板或斜面上划线，分别于37 ℃、27 ℃进行培养，一般24 h后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37 ℃条件下培养6 h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。
　　无菌试验时，如果酚红肉汤连续三次发生变色反应(由红色变为黄色)或产生混浊，或平板（或斜面）培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。有时酚红肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑染菌，并经镜检等其他方法确认连续三次样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。一般来讲，无菌试验的酚红肉汤或培养平板（或斜面）应保存并观察至本批(罐)放罐后12 h，确认为无杂菌后才能弃去。
　　

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三、发酵染菌原因分析
　　发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验教训，积极采取必要措施，把杂菌消灭在发生之前。如果对已发生的染菌不作具体分析，不了解染菌原因，未采取相应的措施来防止染菌，将会对生产造成严重的后果。造成发酵染菌的原因有很多，且常因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不善等是造成各厂污染杂菌的普遍原因。表8-1是日本工业技术院发酵研究所1965年对抗生素发酵染菌原因分析，表8-2为某厂链霉素发酵染菌分析，表8-3是上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌分析。

表8-1　日本工业技术院发酵研究所1965年对抗生素的发酵染菌原因分析


表8-2　某厂链霉素发酵染菌原因分析


表8-3　上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌分析


　　 由上述表中可以看出，由于不同厂家的设备渗漏几率、技术管理好坏不同，而使各种染菌原因的百分率有所不同，其中尤以设备渗漏和空气带菌造成染菌较为普遍且严重。值得注意的是，不明原因的染菌，分别达24.91％、35.00％和35.13％。这表明，目前分析染菌原因的水平还有待于进一步提高。

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㈠ 染菌的杂菌种类分析
　　对于每一个发酵过程而言，污染的杂菌种类的影响是不同的。如在抗生素的发酵过程中，青霉素的发酵污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害更大；链霉素的发酵污染细短杆菌、假单胞杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌更有危害；四环素的发酵过程最怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌；柠檬酸的发酵最怕青霉菌的污染；谷氨酸发酵最怕噬菌体污染。因噬菌体蔓延迅速，难以防治，容易造成连续污染。若污染的杂菌是耐热的芽孢杆菌，可能是由于培养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角等引起；若污染的是球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌，可能是由于种子带菌、空气过滤效率低、除菌不彻底、设备渗漏和操作问题等引起；若污染的是真菌，就可能是由于设备或冷却盘管的渗漏（一般是浅绿色菌落）、无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当（一般是霉菌）、糖液灭菌不彻底(特别是糖液放置时间较长)而引起。