第三节 食用菌母种生产技术
母种生产主要包括培养基制备、纯种分离或转管扩大、培养等环节。
一、母种培养基制备
1.母种培养基常用配方
(1)PDA培养基:马铃薯(去皮,下同)200克,葡萄糖20克,琼脂18-20克,水l000毫升。
(2)加富PDA培养基
① 综合PDA培养基:马铃薯200克,葡萄糖20克,磷酸二氢钾3克,硫酸镁1.5克,维生素B110毫克,琼脂18-20克,水1000毫升。
② 蛋白胨-综合PDA培养基:在加富PDA培养基①中添加5克蛋白胨。
③ 麦麸-PDA培养基:在培养基(1)中添加100克麦麸。
④ 麦芽汁-PDA培养基:在培养基(1)中添加50克大麦芽。
(3)鲜蘑菇浸出液培养基:鲜蘑菇200-250克,葡萄糖20克,琼脂18-20克,水1000毫升。将蘑菇切碎,煮30分钟,取其液汁。
(4)粪汁培养基:干马粪或牛粪150克,葡萄糖20克,琼脂20克,水1000毫升。将马粪或牛粪打碎,煮沸30分钟,取其溶液。
(5)完全培养基(CM)培养基:蛋白胨2克,葡萄糖20克,磷酸二氢钾0.46克,硫酸镁0.5克,磷酸氢二钾1克,琼脂18-20克,水1000毫升。
2.母种培养基制作方法
不同配方培养其制作方法基本相同,现以综合PDA培养基为例介绍其制作方法。
(1) 培养基制作。将土豆洗净、去皮、挖去芽眼及变青绿部分,称取200克,切成约长宽各2厘米厚3毫米左右的薄片,在1200毫升水煮沸10-15分钟,然后用4-6层纱布过滤,倒掉残渣并洗净铝锅。将滤液倒入锅内,加清水补足 1000毫升,同时放入琼脂并重新开始加热,最好小火加热,不断搅拌至琼脂完全溶化,再用纱布过滤一次,补水至1000毫升。最后依次将称好的葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素加入,继续加热并搅拌至全部溶化,停止加热。如果要加入蛋白胨需将蛋白胨用冷水溶化后加入,可以避免蛋白胨因结块而分散不均。
(2) 分装试管。左手持3-4支试管,管口朝上,令下端整齐,上移试管至漏斗软管,插入试管内约3厘米。右手捏紧软管止流夹,使培养基液体流入试管,准确掌握液体培养基装入试管的数量,直立试管时液体高度约为试管长度的l/5即可。此时松开止流夹液体停止流入。将试管下移离开软管,再分装第2支试管,周而复始,直至全部装完。分装试管要求速度快,尤其在低温季节操作,以防止培养基凝固。装量要准确,因为装量偏多摆成的斜面变短,又浪费培养基。装入量偏少则使摆成的斜面太薄,营养少,菌丝难以正常生长。注意避免将培养基沾附到试管管口,以免造成粘着棉塞现象,还易引起棉塞上滋生杂菌,给菌种质量留下隐患(图3-11)。
(3)棉塞制作。试管分装好后,要塞好棉塞,棉塞要用普通棉花,不能用脱脂棉。棉塞制作方法多样,现介绍一种常用制作方法:取棉花适量,做成一均匀片(步骤1),从一边向里折叠,使之成为一条整齐的边(步骤2)。再将相邻的另一边向里折叠,使第二边与和第一边成直角(步骤3)。顺着第二边将棉花卷紧(步骤4),成为柱形,末端的棉絮自然平贴在棉柱上(步骤5)。将毛茬的一边折转平贴在棉柱上(步骤6),将此端塞入试管口。棉塞的2/3塞入试管中,管外留1/3(步骤7),制作过程如图3-12所示。
(4)试管包扎。试管塞好棉塞后,取7支同样规格的试管,用牛皮纸或双层报纸将棉塞端包住,并向下延伸到试管中部,用粗棉线将其扎成一把。
(5)培养基灭菌。母种培养基多采用手提式高压灭菌锅进行灭菌,灭菌操作过程如下:
① 检查高压蒸汽灭菌锅的压力表及各部位是否灵活、可靠,尤其注意检查安全阀是否发生堵塞或锈死。
② 加水。在锅内加入约3千克自来水,加至支架下缘。
③ 装培养基。将捆好的培养基棉塞向上垂直放入灭菌筐(桶)。
④ 封盖。将锅盖上垂下的排气管插入套筒内壁的导气管中,然后用双手同时用力,分别将对角线方向的两个螺丝拧紧。
⑤ 排冷空气。封盖后关闭排气阀开始加热,当加热至压力达0.05兆帕时,打开排汽阀,排尽冷空气,待压力降至零后,即可关闭排气阀。最好依上法排两次。继续加热,当压力升至0.11兆帕时,开始计时,在0.11-0.14兆帕压力下保持30分钟,停止加热。使其自行冷却降压至0。打开排汽阀,再将锅门打开一条10厘米左右的缝隙,利用锅体余热将棉塞烘干。如果不进行棉塞烘干的程序,棉塞潮湿易滋生霉菌。
(6)摆放斜面。观察到报纸干燥后,打开锅盖,当培养基温度降到60℃左右时及时取出摆放斜面。如果在桌上放置1厘米高的小木条,将试管斜放其上,摆成斜面。注意培养基要盖住试管底,斜面长度应以试管长度的1/2左右为好,最多不超过试管长度的3/4(图3-13)。当试管内培养基完全凝固后收起备用。制备好的培养基应放置在通风干燥处保存。
如果温度很高时就摆放斜面,培养基凝固后表面会出现较多的冷凝水,不利菌丝生长。在摆放好斜面后,用厚实的棉布覆盖住培养基,使培养基缓慢降温冷却,也可减少冷凝水出现。
(7)无菌检查。随机抽取几支试管放入37℃左右恒温箱中培养2-3天,若无杂菌生长便可放心使用。
(8)灭菌锅的维护。灭菌结束后,应趁热将国内余水倒掉,当锅内壁干燥后盖好锅盖,将表面擦拭干净后妥善保存。