野生桑黄菌种分离与培养特性研究初报

易菇

雷萍 孙悦迎 张文隽 张慧
陕西省微生物研究所,西安710043

　　桑黄属担子菌亚门（Basidiomycotina）,层菌纲（Hymenomycetes）,非褶菌目(Aphyllophorales), 锈革孔菌科（Hymenochaeyaceae）,针层孔菌属(Phellinus)，是火木层孔菌(P. igniarius)，鲍氏针层孔菌(P. baumii)和裂蹄针层孔菌(P. linteus)的俗称（商品名），生长于杨、桑、柳、白桦、榉和桃等阔叶树的枯立木、立木及树干上[1]。桑黄初期像一块黄土，经过一段时间的生长，样子像树桩上伸出的舌头[2]。子实体多年生，侧生无柄，硬木质、蹄形、扁半球形或不规则形，盖面浅肝褐色至灰褐色或黑色，初时有细绒毛，老后常有明显的纵横龟裂，有同心环棱，边缘钝，有黄色翻边，菌肉蛋黄色或浅咖啡色，木质，菌管多层，层次不明显[3]。桑黄因其寄生树种不同，其形状、颜色及含有的成分亦不同。目前，市场上销售的桑黄有桑树桑黄、松树桑黄、杨树桑黄和白桦桑黄等，其中桑树桑黄为极品，价格最高。
　　桑黄是一种珍贵的药用真菌[3-5]，有“森林黄金”之美称。《中药大辞典》记载，子实体入药，可治血崩、血淋、带下和闭经等妇科疾病[6]，其抗菌、抗癌、抗纤维化和抗氧化等效果也很显著，因而成为国际研究领域的研究热点，特别是日本和韩国，对其进行了广泛深入的研究。由于桑黄价格昂贵及供不应求，必然导致人们对桑黄菌的无序采集，加上桑黄菌本身生理生态的特殊性和复杂性，以及外部条件的制约，自然界中形成的桑黄子实体非常稀少，使得天然桑黄资源匮乏，面临枯竭。由于桑黄的生长周期相当长，要长成适合药用的大小，需要20~30年的时间，所以对其进行人工栽培非常重要。本文拟通过分离野生桑黄纯种，对其培养特性进行研究，为实现桑黄人工栽培和商品化、规模化栽培，同时也为桑黄发酵产品及其制剂生产做一些基础工作。
　　1　材料与方法
　　1.1　材料
　　1.1.1　桑黄
　　桑黄子实体采自陕西省宁陕县自然保护区海拔约1800 m左右的桦树枯木上。选尚未木质化、无任何破损的子实体，用纸包好带回实验室。
　　1.1.2　分离培养基
　　加富PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO3 1 g，MgSO4 0.5 g，维生素B110 mg，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH自然。
　　1.2.3　碳源测定基础培养基
　　蛋白胨5g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，维生素B110 mg，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH自然。
　　1.2.4　氮源测定基础培养基
　　葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，维生素B110 mg, 琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH自然。
　　1.1.5　栽培培养基
　　桑树锯木屑培养基：桑树锯木屑100%，含水量60%~62%。将新鲜无杂质的桑树锯木屑按比例加水，混合均匀至用手轻轻捏成团、指缝间有水而不流、触之即散，然后装入500 mL广口瓶，每瓶装干料150 g，瓶口用两层薄纸外加一层防潮塑料扎好，0.1 MPa灭菌2 h。
　　鲜桑树枝木段培养基：取直径3~5 cm的新鲜桑树枝，锯成4 cm长的木段，每条劈两块，装入广口瓶（瓶口直径7.5 cm，高12 cm），每瓶装12块，瓶口同样用两层薄纸外加一层防潮塑料扎好，0.1 MPa灭菌2 h。
　　1.2　方法
　　1.2.1　桑黄子实体处理
　　 取新鲜桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质，用75%的酒精擦洗固体外表面5次进行消毒，然后置于无菌烧杯中备用。
　　1.2.2　桑黄组织分离法
　　将已处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用已灭菌的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入无菌平板培养皿表面，倒置于25 ℃恒温箱中培养。待长出菌丝后，取生长快、菌丝长的菌丝块，移入另一无菌平板培养皿表面培养，待长出菌丝后，取生长快、无杂菌污染的菌丝块，移入斜面培养基表面，25 ℃培养12 d、菌丝长满斜面且无杂菌，即为桑黄菌母种。
　　1.3　野生桑黄菌人工培养条件的研究
　　1.3.1　温度试验
　　试验选用加富PDA培养基为基础培养基，设13、18、23、28、33和38 ℃ 6 个温度处理，每个处理重复5次。接入组织分离的桑黄菌种，培养6 d，以平板培养基上菌丝生长速度作为菌丝生长量指标，取其平均值，比较不同温度对桑黄菌丝生长的影响（接种块萌发快慢、菌丝生长快慢都影响试验结果，因此在菌种萌发后长出1 cm左右画起始线，快长满培养皿时画终止线，两线之间的距离除以天数，即为生长速度cm/d, 下同）。
　　1.3.2　pH试验
　　试验选用加富PDA培养基为基础培养基，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCI将培养基pH分别调节到5.5、6.0、6.5、7.0和7.5五 个不同的处理，每个处理重复5次。接种桑黄母种，28 ℃培养6 d，以平板培养基上菌丝生长速度作为菌丝生长量指标，取其平均值，比较不同pH对桑黄菌丝生长的影响。
　　1.3.3　碳源试验
　　碳源测定基础培养基5份，分别添加2%的蔗糖、2%的可溶性淀粉、2%的葡萄糖、2%玉米粉和2%的麦芽糖。每个培养皿内分别加入20 mL培养基，每组由5个平板组成。将桑黄菌种接入制备好的平板中， 28 ℃培养6 d，以平板培养基上菌丝生长速度作为菌丝生长量指标。实验重复5次，取其平均值，比较不同碳源对桑黄菌丝生长的影响。
　　1.3.4　氮源试验
　　氮源测定基础培养基5份，分别添加0.5%的蛋白胨、0.5%的（NH4）2SO4、0.5%的NH4NO3、0.5%的牛肉浸膏和0.5%的酵母膏。每个培养皿内分别加入20 mL培养基，每组由5个平板组成。将桑黄菌种接入制备好的平板中，28 ℃培养6 d，以平板培养基上菌丝生长速度作为菌丝生长量指标。实验重复5次，取其平均值，比较不同氮源对桑黄菌丝生长的影响。
　　1.3.5　桑树锯木屑和鲜桑树枝木段培养基栽培试验
　　将桑黄母种分别接种在桑树锯木屑培养基内或鲜桑树枝木段条块表面，28 ℃培养45 d，每天记录桑黄菌丝生长情况, 测定不同栽培培养基对桑黄菌丝生长的影响。
　　2　结果与讨论
　　2.1　野生桑黄的培养特性
　　2.1.1　菌丝生长特性
　　菌丝生长慢，2周内覆盖平板。生长新区锯齿状，白色，轻微升起的气生菌丝延伸到生长区的边缘。菌落白色至微带奶油色、黄褐色、蜜黄色。边缘绒毛状，较老的部位为棉花状和羊毛状、毡状。生长新区反面无变化，老区反面奶油黄色到黄褐色。
　　2.1.2　菌丝特征
　　生长新区的菌丝薄壁，透明，有一主干，呈树枝状分枝，具不明显的简单分隔，直径3.0~6.0 μm。气生菌丝如生长新区的菌丝，纤维菌丝或多或少具加厚的壁，微绿色至黄色到褐色，稀少分枝，不分隔，直径1.0~3.0 μm，菌丝上具连续的不规则膨大的表皮细胞，念珠状，薄壁，偶尔呈直角分枝，内含物丰富，直径5.0~7.0 μm。基内生菌丝如生长新区的菌丝。
　　2.2　野生桑黄菌人工培养条件研究结果
　　2.2.1　温度对桑黄菌丝生长的影响
　　桑黄菌丝对温度的变化很敏感，菌丝生长速度随温度的升高而加快，28 ℃时最快，随后又逐渐降低（表1）。从表1可以看到，桑黄菌丝在13~38 ℃的范围内均能生长，最适生长温度为28 ℃。
表1 不同温度对桑黄菌丝生长的影响

　　1）表中数据为5次重复的平均值
　　2）“+++”表示菌丝生长势强，“++”表示菌丝生长势一般，“+”表示菌丝生长势弱
表2 不同pH对桑黄菌丝生长的影响

　　1）表中数据为5次重复的平均值
　　2）“+++”表示菌丝生长势强，“++”表示菌丝生长势一般，“+”表示菌丝生长势弱
　　表3 不同碳源对桑黄菌丝生长的影响

　　1）表中数据为5次重复的平均值
　　2）“+++”表示菌丝生长势强，“++”表示菌丝生长势一般，“+”表示菌丝生长势弱
　　2.2.2　pH 对桑黄菌丝生长的影响
　　不同pH对桑黄菌丝生长的影响见表2。从表2可以看到，桑黄菌丝在pH5.5~7.5的范围内均能生长，最佳pH是6.5。
　　2.2.3　碳源对桑黄菌丝生长的影响
　　不同碳源对桑黄菌丝生长的影响见表3。从表3可以看到，桑黄菌丝在供试的5种培养基上均可生长，但在添加葡萄糖的母种培养基上菌丝浓密健壮，生长势旺盛；在添加麦芽糖的母种培养基上生长势最弱。因此，桑黄菌丝生长的最佳碳源是葡萄糖。
　　2.2.4　氮源对桑黄菌丝生长的影响
　　不同氮源对桑黄菌丝生长的影响见表4。从表4可以看到，桑黄在供试的5种氮源培养基上均可生长，但在以蛋白胨为氮源的培养基上菌丝生长速度最快，且菌丝浓密健壮，生长势旺盛；在以酵母膏为氮源的培养基上菌丝生长势最弱。因此，桑黄菌丝生长的最适氮源是蛋白胨。
　　2.2.5　桑树锯木屑和鲜桑树枝木段对桑黄菌丝生长的影响
　　桑黄菌丝在两种不同培养基上的生长见表5。从表5可以看到, 在鲜桑树枝木段培养基上桑黄菌丝生长良好，虽然菌丝长满瓶时间较晚, 但菌蕾出现早(菌蕾初期如拇指大小，扁半球形或马蹄形，1.5×3.0 cm，厚0.5~1.0 cm，浅肝褐色至暗灰色，有同心环棱，边缘钝)；在桑树锯木屑培养基上桑黄菌丝生长速度快，菌丝满瓶早，但菌蕾出现晚。由此可见, 鲜桑树枝木段是桑黄菌丝人工栽培的最佳培养基。
表4 不同氮源对桑黄菌丝生长的影响

　　1）表中数据为5次重复的平均值
　　2）“+++”表示菌丝生长势强，“++”表示菌丝生长势一般，“+”表示菌丝生长势弱
表5 不同栽培培养基对桑黄菌丝生长的影响

　　3 讨论
　　3.1试验结果表明，桑黄菌丝生长的最适温度为28 ℃；最适pH为6.5；最适碳源是葡萄糖；最适氮源是蛋白胨；最适栽培培养基为鲜桑树枝木段培养基。本研究为桑黄菌种生产、菌丝体发酵及子实体人工栽培培养基配方和条件的确定提供了参考。
　　3.2采用桑树锯木屑和鲜桑树枝木段作培养基对桑黄菌进行模拟野生生态条件培养，可促使人工培养桑黄长出菌蕾，但子实体生长不正常，其机理尚有待于进一步的研究。

　　参考文献：（略）
　　常用计量单位符号　1、时间：d（天）、h（小时）、min（分）、s（秒）。　2、长度：km（千米）、m（米）、cm（厘米）、mm（毫米）。　3、面积：m2（平方米）、667m2（亩）、hm2（公顷）。　4、体积：m3（立方米）、L（升）、ml（毫升）、μl（微升）。　5、质量：t（吨）、kg（公斤 千克）、g（克）、mg（毫克）、μg（微克）。　6、浓度：mg/L、mg/kg（ppm,1×10-6）。

gzm888

好东西 后续能多发些 俺要多学习下

gzm888

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行者或过客

gzm888 发表于 2014-2-4 18:19
好东西 后续能多发些 俺要多学习下

学界的东西，才是比较规范的，科学性更强！