二.生活条件
(一)温度
用大麦芽培养基,在250mL三角瓶中装50mL培养液,重复3次。接种后分别置12.5℃, 15℃,20℃,22.5℃, 25℃, 30℃,35℃,40℃的恒温摇床中培养,转速都为145r/min,培养6d后,离心后清水洗涤2-3次后收集菌丝体,100℃烘干2h,称取干重。对试验数据进行统计分析,菌株Ps.222的菌丝生长量y(g/100mL)与温度(t)的的关系式为:y=3 t2+147.6t-107.3,当t=24.6℃时取得最大值,其最适温度为20℃-25℃。
表1 不同温度、pH、C源、N源的菌丝体生长量(mg/100mL)
温度 |
12.5 |
15 |
20 |
22.5 |
25 |
30 |
35 |
40 |
|
|
产量 |
602 |
633 |
679 |
751 |
742 |
655 |
613 |
546 |
|
|
pH值 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
产量 |
180 |
630 |
690 |
710 |
750 |
860 |
870 |
920 |
840 |
750 |
C源 |
淀粉 |
蔗糖 |
麦芽糖 |
葡萄糖 |
纤维素 |
乳糖 |
木糖 |
甘露糖 |
果糖 |
|
产量 |
1220 |
820 |
960 |
1050 |
960 |
850 |
790 |
980 |
850 |
|
N原 |
玉米粉 |
蛋白胨 |
酵母膏 |
氯化铵 |
尿素 |
硫酸铵 |
硝酸钾 |
硝酸铵 |
乙酸铵 |
|
产量 |
1720 |
1180 |
1320 |
680 |
480 |
890 |
810 |
650 |
560 |
|
(二)pH值
用大麦芽培养基,将培养液的pH值分别调至3-12,级差为1,共10个处理。重复3次,每个三角瓶装50mL培养液,灭菌后等量接种, 25℃,145-150r/min恒温摇床上培养 6d,离心后清水洗涤2-3次后收集菌丝体,100℃烘干2h,称菌丝体干重。根据试验数据进行统计分,菌株Ps.222的菌丝生长量y(mg/100mL)与pH(x)的关系为:
y=-17.311x2+238.23x+71.167
F检验:F=18.079>F0.01, 差异极显著,当pH=6.9时ymax=891达最大值。所以考虑pH值的范围,菌丝培养最适宜的pH应为6~7。
(三)C源
在无碳培养液(硝酸钾为N源,N%为0.2%) 分别用淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、纤维素、乳糖、木糖、甘露糖、果糖等9种C源,浓度均为2%。结果如表3所示,各种单糖、 双糖、多糖对三个菌株菌丝体生长都有利。其中麦芽糖、葡萄糖、果糖产量都很高,纤维素的产量很低。Ps.222对甘露糖的产量最高。试验结果中可溶性淀粉的产量仍然很高,原因是淀粉灭菌结块后很难洗涤干净,纤维素也存在同样的问题。考虑生产成本,在研究和生产中一般可以选择葡萄糖或蔗糖为培养菌丝体的C源,而不用乳糖或果糖。
黄褐裸盖伞不能同化利用d-半乳糖、L-山梨糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、乳糖和木聚糖;对D-果糖的同化利用能力最强;对葡萄糖、D-甘露糖、麦芽糖、D-木糖和蔗糖也有很强的同化利用能力;可以利用D-山梨醇、可溶性淀粉、糊精和纤维素。表明黄褐裸盖伞具有一定活性的纤维素酶,能够分解利用糊精和纤维素;产半纤维素酶的能力较弱,不能分解利用木聚糖。
(四)N源
在无氮培养液(2%葡萄糖)中分别加入玉米粉、蛋白胨、酵母膏、NH4Cl、尿素、(NH4)2SO4、KNO3、NH4NO3、乙酸铵等作为氮源,N%均为0.2%。菌丝体生长量在以玉米粉、蛋白胨、酵母膏为N原的培养基中的产量很高,其他有机N原,NH4+-N,NO3--N的产量较低。天然有机氮源产量很高,可能与其中还含有C源、生长因子和矿质元素等营养物质有关。
黄褐裸盖伞不能同化利用尿素和亚硝酸钠;对干酪素钠的同化利用能力最强;对酵母粉、琥珀酸铵和甘氨酸也具有很强的同化利用能力;可以利用蛋白胨、酒石酸铵、草酸铵、、硫酸铵和硝酸钠。表明该真菌不能分泌尿酶,不能利用亚硝酸盐,对无机氮源的同化利用能力较有机氮源差。
(五)C/N比
固定2%碳源量,用硝酸钾作N源,将C/N比分别调为10:1,15:1,20:1,25:1,30:1,40:1,50:1,75:1,100:1。试验结果表明,菌丝体适宜的C/N较广泛,C/N从10:1到100:1均可生长良好。以25:1-50:1为各菌株菌丝体生长的最适C/N。
(六)PO43-浓度
在培养液中加KH2PO4,浓度调为0.01%-0.10%,级差为0.01%。由表4可知,PO43-浓度对三种菌的影响无规律,Ps.205的最适 PO43-浓度为0.8% -0.9%。Ps.222的最适 PO43-浓度为0.8%-0.9%。Ps.807的最适 PO43-浓度为0.9%-1.0%。
表2 PO43- 、Mg2+ 、K+浓度对菌丝体生长量的影响(mg/100mL)
[PO43-]/% |
0.1 |
0.2 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
0.6 |
0.7 |
0.8 |
0.9 |
1.0 |
产量 |
980 |
890 |
970 |
1340 |
870 |
1010 |
1120 |
1560 |
1360 |
700 |
[Mg2+]/% |
0.01 |
0.02 |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
0.06 |
0.07 |
0.08 |
0.09 |
0.10 |
产量 |
630 |
860 |
790 |
920 |
810 |
740 |
760 |
860 |
1070 |
1100 |
[K+]/% |
0.01 |
0.02 |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
0.06 |
0.07 |
0.08 |
0.09 |
0.10 |
产量 |
1023 |
1100 |
954 |
962 |
845 |
754 |
861 |
675 |
632 |
641 |
(七)Mg2+浓度
在培养液中加MgSO4,浓度调为0.01%-0.10%,级差为0.01%。Mg2+浓度对菌丝体的生长影响明显,Ps.222的最适浓度为0.10%。
(八)K+浓度
在培养液中加KCl,浓度调为0.01%-0.10%,级差为0.01%。试验表明,菌丝体生长量有随K+浓度升高而降低的趋向,说明K+离子对菌丝体生长有一定抑制作用。不需要特别向培养基中加入钾。
(九)液体培养时间
用大麦芽培养基,在500mL三角瓶中装100mL培养液,共60瓶。灭菌后等量接种,振荡培养,25℃,145r/min,每天取3瓶测定菌丝体的干重,绘制生长曲线。根据试验结果进行统计分析可知,菌株Ps.222菌丝体生长曲线方程为:y=﹣33.61 x2﹢427.24x﹢461.25,它的最大值为1819,取得该值时x=6.4。菌丝体的最适培养时间为5-7天。
第三节 菌种生产
一. 菌种分离
母种培养基配方:
PN培养基:松针50~100g,葡萄糖20g,蛋白胨5g,琼脂20g。
MA培养基:麦芽30~50g,葡萄糖20g,蛋白胨3g,酵母粉1g,琼脂20g。
用松针或麦芽的提取液作母液,加上蛋白胨、葡萄糖、琼脂制成培养基。灭菌、冷却然后接种,25oC恒温培养,待菌丝长满斜面后接原种。
在无菌条件下,从菌盖、菌柄的中央挑取菌肉组织,放在试管斜面培养基的中部。25℃培养2~3天后,组织块周围长出新菌丝体,从边缘2~5mm处挑取菌丝体,转接到新培养基上;如此2~3次转接,可以得到纯菌丝体的培养物。
二.母种、原种及栽培种培养
原种、栽培种培养基配方:牛粪粉30%,出菇废料30%,棉籽壳30%,麸皮8%,石灰2%。
将培养料装入500mL三角瓶、菌种瓶内,高压灭菌后冷却,接种然后放入培养箱内25 ℃温度下进行恒温培养,到菌丝长满时再接栽培种。
第四节 栽培方法
一.原料与配方
毒裸盖伞是一种草腐生蕈菌,适宜其子实体生长的原料有:各种食用菌栽培出菇的废料、稻麦草粉、发酵棉籽壳、马粪、牛粉。一般不要使用木屑。其配方如下:
1.出菇废料100%
2.稻麦草粉50%,发酵棉籽壳50%
3.出菇废料25%,稻麦草粉25%,发酵棉籽壳25%,牛粪粉25%
4.出菇废料75%,发酵棉籽壳25%
5.出菇废料50%,牛粪粉50%
6.稻麦草粉50%,出菇废料25%,牛粪粉25%
7.稻麦草粉50%,发酵棉籽壳25%,牛粪粉25%
二.季节
毒裸盖伞是一种低温型蕈菌,子实体形成和生长适宜的温度范围为5~22°C,最适宜的温度为15~20°C。出菇的季节为10月~次年3月,春秋两季最适合出菇。冬天栽培温度较低、夏季温度较高都可以在温度较恒定的地下室进行出菇。
三.栽培方法
试验性栽培可以直接在菌种瓶中进行。或把长满菌丝体的培养料从菌种瓶中掏出,放在盆或箱中,覆盖1~2cm的土壤,保持85%~90%的空气相对湿度,进行出菇。
规模化栽培可以选用35~45′15~24大小的菌袋培养菌丝体。当菌丝体满袋后,将菌袋立放,打开一端,直接或覆盖1~2cm的土壤,保持85%~90%的空气相对湿度,进行出菇。
用出菇废料、稻麦草粉、发酵棉籽壳、生棉籽壳、牛粪粉等为材料进行栽培,接种后2~3天开始吃料,10~12天时均有原基形成,在菌丝未满瓶时会形成子实体。
毒裸盖伞的子实体可以直接在培养料上形成和发育,也可以在覆土层上形成,可见覆土不是必须条件,但是为了出菇管理特别是便于水分管理,最好在培养料表面覆上一层土。覆土材料为壤土、炭渣或二者的混合物,经过杀虫处理后就可以覆在培养料表面,覆土厚度为1.5~3.0cm。
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