[转帖]食用菌分子生物学研究进展

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作者：仲恺          摘自【农业工程学院学报】

        生命科学因现代分子生物学的不断发展而逐渐成为21世纪科技革命的主流．相对于动植物而言，食用菌分子生物学研究工作起步较晚，同时由于市场的狭小和缺少对食用菌研究的大量投资，导致食用菌分子生物学研究滞后．但鉴于食用菌生活周期短、基因组小、实验操作技术简便等特点，从而吸引了遗传育种学家注意力，这就是近年来食用菌遗传育种研究，特别是分子生物学方面发展较快的主要原因．

由于食用菌具有特殊的香味，且具有低热量、低脂肪的营养特点和降血压、抗肿瘤及增强机体免疫力的功效，因此愈来愈受到广大消费者的喜爱．传统的遗传育种方法周期长、见效慢，现代分子生物技术为高产、优质、抗逆、强适应性菌株的筛选提供了一种更为高效快捷的物种改造方式，作者对食用菌分子生物学研究进展进行综述，希望能够供相关研究与应用参考．

1  食用菌转基因研究

最早报道的食用菌转化是Challen等利用聚乙二醇(PEG)法把外源DNA导入双孢蘑菇(Agaricus bisporus Imbach)的原生质体中，获得转化子．随后一些学者又相继报道了几例食用菌如平菇(Pleuro- tus astreatus Quel．)、草菇(Volvariella volvacea Sing．)、杨树菇(Agrocybe aegerita Sing．)和香菇(Lentinus edodes)的遗传转化取得成功．

1．1常用筛选标记

    目前食用菌常用的筛选标记主要有营养缺陷型标记、抗生素抗性标记和代谢物抗性标记3种类型．

  1．1．1  营养缺陷型标记该标记基因来自宿主本身，属于同源转化，易引导载体在染色体的同源部位整合和基因表达．目前已有营养缺陷型标记基因Ural(二氢乳清酸)、Pabl(p一氨基苯甲酸)、rr#(色氨酸)等基因成功应用于杨树菇、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus s．F．Gray)、双孢蘑菇的遗传转化的报道．基于同源转化的高转化率和高安全性，营养缺陷型标记都是一种优良的选择标记，但食用菌营养缺陷型菌株不易获得，因而限制了这种筛选标记的应用．

  1．1．2抗生素筛选标记在食用菌转化研究中使用过的抗性标记基因有潮霉素抗性基因(Hygr或Hpt)、

  腐草霉素抗性基因(Phlr)、博来霉素抗性基因(Bler)等．其中应用最多的是潮霉素抗性基因Hygr，现已经在平菇、香菇、双孢蘑菇中获得表达，并以在香菇的转化中效果较好．

  1.1．3代谢物抗性标记r,p3的突变基因Trp3iar来源于灰盖鬼伞中分离出的5一FI抗性菌株，是第一个分离自担子菌的阳性标记基因，可以导致对代谢物5一氟基吲哚(5-fluoroindole，5一FI)的抗性；将Trp3iar 作为筛选标记用于平菇和草菇的转化，得到了5一FI抗性转化子．这个标记基因属于近同源基因转化，不易甲基化，易于表达，适于在食用菌遗传转化上应用．

    1．2常用启动子

    目前在食用菌转化领域，对启动子的研究主要集中在强启动子和同源启动子方面，因为不同的启动子会影响食用菌转化效率和外源基因表达．目前常用的启动子主要有RAS基因启动子和GPD基因启动子。

     1．3  常用方法

    食用菌遗传转化方法多借鉴成功的动物、植物、微生物转化方法，目前主要有以下几种：

  1．3．1  聚乙二醇法(PEG)PEG法对原生质体的损伤相对较小，而且方法简便，是食用菌遗传转化中应用最多的一种方法，已在双孢蘑菇、平菇、草菇等食用菌中成功应用．王春晖等曾采用PEG法将平菇DNA导入草菇原生质体，选育出菇型、酶活力及生物转化率与亲本有显著差异的V157-1菌株．但该方法转化率较低，通常为10-5一10-6．

  1．3．2  电激法Challen等首先应用此法把URAl转入同源的杨树菇营养缺陷型菌株中获得转化子，尔后用于双孢蘑菇和平菇的转化．贾建航等采用该技术将香菇DNA、糙皮侧耳(Pleurotus ostrea- tus)DNA分别导人平菇、紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)原生质体中，并得到了转化子．与PEG法相比，电激法可电激原生质体、菌丝体或完整细胞，操作更为简便，需要的DNA也较少，但对转化体的损伤较大，转化率也比较低．

  1．3．3  限制性酶介导整合法  (Restriction enzyme-mediated integration，REMI)Sehiestl等于1991年首次利用该法在酿酒酵母转化上获得成功，随后相继在盘基网柄菌(Distyostelium discoideum)、担子菌灰盖鬼伞、香菇等转化上取得成功．REMI法由于限制性内切酶的定位作用可大幅度地提高整合率，进而大幅度提高转化率，但酶的种类与浓度会影响转化率，且易引起突变而产生假阳性．

  1．3．4农杆茵介导转化法De-Groot等1998年首次用该法转化了丝状真菌(曲霉启动子)，但转化率很低．此后，用双孢蘑菇的幼嫩菌褶组织、菌丝体和担孢子萌发菌丝与农杆菌(Agrobacterium)共培养，获得了稳定的转化子，转化率高达30％一40％，表明同源启动子转化率高．Leach等使用该法以

  菌丝组织为转化材料转化了双孢蘑菇和枯草杆菌(芽胞杆菌(BaciUu subtilis)(Ehrenberg)Cohn)抗潮霉素标记基因(Hph)，避免了以原生质体为转化材料的缺点．

  1．4存在问题

    目前在食用菌的转化研究中主要存在假阳性菌落的干扰、外源DNA整合率、外源基因整合后表达率不高以及转化子不稳定等问题．其中影响转化的主要因素是低整合率和低表达率．因此在未来食用菌转化研究方面仍然需要继续探讨转化方法、转化材料、标记基因、启动子等，建立一个完善的转化体系，如引入特殊序列、构建高效表达载体、使用增强子等．从而提高遗传转化的整合率和表达率．

  2 DNA分子标记研究

随着分子生物学技术的发展，目前已经开发了几十种基于DNA序列多态性的分子标记，如随机扩增多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列长度多态性(sSLP)、简单重复序列间扩增(Is— sR)、序列标记位点(STS)、单核苷酸多态性标记(SNP)、特征片段扩增区域(sCAR)、核糖体DNA(rD— NA)、相关序列扩增多态性(sRAP)、靶位区域扩增多态性(TRAP)等，并应用于食用菌的种质资源与菌种菌株鉴定、遗传多样性与亲缘关系分析、遗传图谱构建及基因定位和克隆等研究领域．

2．1在杂交子、融合子鉴定中的应用

    大多数食用菌的遗传背景不清楚，其形态特征也难于观察和描述，使食用菌育种和遗传分析因缺乏标记而难以深人．分子标记的应用，使食用菌的遗传育种研究有了飞速的发展．在杂交育种中，亲本菌株的选择和对杂种的准确鉴定是关键技术，通常传统的鉴定方法不能从本质上揭示亲本固有的遗传差异，因而在准确性、稳定性或灵敏性方面都不太理想．Khush等1992年首次报道了采用聚合酶链式反应(PCR)技术构建双孢蘑菇的分子标记．之后RAPD、AP-PCR、rDNA、SCAR等分子标记也被相继应用于双孢蘑菇、香菇、金针菇(Flammulina velut咖es Sing．)、凤尾菇(Lentinus sajor-caju)、黑木耳(Auricularia auricula Underw)、野蘑菇(Agaricus arven~is)以及褐色蘑菇(Agaricus 6函porus)等食用菌研究中旧射。

用RAPD技术对香菇的亲本与后代之间进行遗传相关性分析，发现非对称杂交的后代遗传距离与单核受体较近，与双核供体遗传距离较远口副；双单杂交菌株后代基因组也存在不同程度变异．

2．2在菌种及种质资源鉴定上的应用

目前在食用菌生产上主要存在品种退化、菌种老化、病毒感染、品种混杂和杂菌污染等问题，尤其是同种异名、异种同名的现象十分普遍．分子标记技术的发展，给快速鉴定食用菌菌种及种质资源带来方便．RAPD技术是一种快速有效鉴别菌株的方法，广泛应用于金针菇、香菇、木耳、白灵侧耳(Pleurotus nebrodensis Qu61)、灵芝(Ganoderma)、银耳(Tremella如扣rmis Berk)、牛肝菌(Boletus edulis BuU．ex Fr．)等的子实体及组织分离物的DNA多态性分析旧H¨．此外SRAP、ITS(Internal transcribed spacer)、ISSR等方法也有应用[46-50]．如秦莲花等以ISSR引物对香菇属的13个菌株的微卫星区DNA进行扩增，确认了香菇中微卫星(TATG)n序列的存在，认为此标记可用于香菇菌株的遗传分类研究．

2．3  食用菌性状的连锁标记筛选与遗传图谱

目前，找到与食用菌一些性状相连锁的分子标记比较少．而在遗传图谱研究方面，近年来用分子标记仅构建了双孢蘑菇和糙皮侧耳的遗传连锁图[51-521．双孢蘑菇的遗传连锁图是一个集同工酶、RFLP、RAPD、rDNA重复序列以及少量外部表型性状等多种标记的混合标记连锁图，它的建立将为今后进一步分析双孢蘑菇的遗传行为，定位或克隆有关基因提供了一个很好的参照标尺．糙皮侧耳的遗传图谱以RAPD标记为主，辅以RFLP、同工酶、表型(交配因子)标记，该图谱包括了189个位点，分属11个连锁群，覆盖的基因组总长度为1000．7 cm，标记间平均距离为5．3 cm．最近又构建了二极交配型Pho— liota nameko的不亲和性相关蛋白基因(Hoxl)的连锁图[5引．此外用白色金针菇子实体和黑木耳不同交配型的单倍体菌株进行RAPD分析找到了连锁基因．

2．4食用菌遗传多样性研究

    目前，通过分子标记揭示不同物种DNA分子水平上的多态性用于食用菌野生种质资源的收集、保存、评价和利用，以及食用菌种质资源的生物多态性和遗传多样性，已成为食用菌遗传育种领域中一个重要的研究方向．应用RAPD、RFLP等分子标记在香菇、双孢蘑菇、侧耳、金针菇、柳松菇(Agrocybe cylindra- ce口)、羊肚菌(Morchella esculenta Pers．)、松茸(Tr／cho／oma matsutake)、秀珍菇(Pleurotus pulmonarius)、乳菇(Lactarius deliciosus Gray)等的研究报道较多．另外，应用分子标记进行真菌遗传多样性和亲缘关系分析在灵芝属(Ganoderma)、蜜环菌属(Armillaria)、块菌属(Tube)、木耳属(Auricularia)、鹅膏菌属(Amanita)等属种上也有一些报道L64-65j．利用ISSR标记研究松口蘑(Tr／cho／oma matsutake)和隐花青鹅膏菌(Amanita mangiana)的居群遗传结构，结果表明遗传变异主要表现在同年生子实体内，隔年生子实体的变异情况也有表现；此外，隔年生子实体的遗传相似性和空间分布关系不完全相同旧。．有学者用ISSR、RELP、RFLP技术对高卢蜜环菌(Amillaria gaUica)、侧耳属菌株、双孢蘑菇、白灵菇(Pleurotus nebrodensis Qu61)、草菇等多个菌株间的遗传系统进化关系进行了研究，发现双孢蘑菇居群和侧耳属菌株存在很高的遗传多样性，而草菇菌株间遗传差异性小．

在食用菌遗传改良过程中，寻找和收集遗传变异丰富的种质资源，以及最大限度地开发利用现有的种质资源至关重要．种质资源的全面而有效评估是一个非常复杂的问题，将现代分子生物学技术结合传统的形态学、生理学研究方法，形成一套有效的从生理形态到细胞、基因水平的种质资源评估方法，将对食用菌的遗传改良起重要作用．

2．5食用菌基因克隆研究

目前在食用菌上克隆的基因不是很多．取得成功的主要有草菇漆酶基因和内切葡聚糖酶基因、香菇线粒体加工肽p亚基基因和疏水蛋白基因、灰盖鬼伞突变体ichijiku开伞基因等，并对其基因序列特征和表达特性进行了分析．

3  展望

    在分子水平上对食用菌遗传物质进行改造所创造的新物种在自然演化中不一定能出现，但作为一种可控的育种手段，必将在食用菌育种中发挥重要的作用．但同时也应看到许多技术自身存在的局限性和不足，如RAPD标记技术存在假阳性高、稳定性和重复性差等缺陷，RFLP和AFLP的操作复杂、周期长、费用高等．而且目前开发的分子标记数量不足，很难找到与目标基因紧密连锁的分子标记，从而构建高精密度遗传图谱的难度很大．随着分子标记技术的深入，更多的食用菌功能基因将被标记，更高密度、更为实用有效的遗传连锁图谱将被建立，大量重要的基因将被定位、分离和克隆，这将为进一步培育高产、优质、抗病、耐贮的食用菌新品种奠定良好的基础．

李永国

毛老师功底太棒了，思维敏捷，工作速度。效率太超乎寻长了，您辛苦了。

wyjshiye

很有指导意义！！！！

田鸿

现在的食用菌分子标记技术有的有先天缺陷，所以结果可能不准确。

ghost9106

QUOTE:

以下是引用田鸿在2010-5-29 9:41:50的发言：
现在的食用菌分子标记技术有的有先天缺陷，所以结果可能不准确。

有什么先天的缺陷，请明示！