[分享]细菌的生理生化反应

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【目的要求】

1．  掌握微生物鉴定中常用的几种生化反应原理及结果判断方法。

2．  熟悉微生物生化反应中各种培养基的设计和用途。

 

一、糖发酵试验

微生物具有不同的利用各种碳源的能力，其原理在于不同微生物具有不同的酶系。微生物利用碳源能力和结果的不同可用于微生物的鉴定。

溴甲酚紫是一种酸碱指示剂，在ph中性时为紫色，碱性时为深红色，而在酸性时呈现黄色。试验时，在各试验管中加一倒置小管，称为杜氏管（Durham tube），分装入试验用培养基，高压灭菌，培养基将压进杜氏管，并赶走管内气体，随后滞留在管内的气体将是由微生物在生长过程中产生的。当溴甲酚紫的颜色由紫色变为黄色时，表明微生物利用碳源产生了酸性物质。

微生物在进行碳源代谢时可以产生不同的代谢产物。有些产物为酸性物质--如醋酸、甲酸以及乳酸等。酸性物质的积累有时会超出培养基的缓冲范围，导致ph下降，溴甲酚紫的颜色由紫色转为黄色。在产酸工程中，有时伴随气体的产生，这可以在杜氏管中的气泡反应出来；若碳源代谢的终产物为中性化合物，既无颜色变化也无气体产生，表明此时的代谢较为复杂。

1．实验材料

（1）细菌：大肠杆菌和伤寒杆菌培养物。

（2）试剂：蛋白胨水培养基，葡萄糖，乳糖，麦芽糖，甘露醇，蔗糖，紫红指标剂，。

（3）其他：接种环、试管、杜氏小管。

2．实验方法

（1） 在试验管上标记好试验用菌的名称。

（2） 使用无菌操作，将试验用菌接入各个试管，第六管为对照，不接种。

（3） 将试验管置于培养箱中，直立放置培养。

（4） 48小时后和5天后检查培养状况。

记录试验结果：NR表示无反应或结果复杂；A表示产酸不产气；“AG”表示产酸产气；“B”表示产生碱性物质。

 

二、IMViC试验

IMViC 是以下四个试验的缩写：吲哚试验（indole production，I）、甲基红试验（methyl red test，M）、V-P试验（Voges-proskauer test，V）和枸橼酸盐利用试验（citrate utilization test，C），字母“i”是为了发音的需要加入的。

IMViC试验常用于革兰氏阴性的肠道细菌检测中。如产气杆菌和大肠杆菌在许多测试中反应很相似，极其容易混淆。IMViC则可以区分产气杆菌属和大肠杆菌属的微生物。

1．实验材料

（1）细菌：大肠杆菌培养物；产气杆菌培养物；普通变形杆菌培养物。

（2）试剂：寇氏试剂、蛋白胨-水-磷酸盐培养基；甲基红试剂；6%α-萘酚；40% KOH溶液；西蒙氏枸橼酸盐琼脂斜面；醋酸铅营养琼脂高层。

（3）其它：接种环等。

2．实验方法

（一）吲哚试验

色氨酸几乎存在于所有蛋白质中，有些细菌可以将色氨酸分解为吲哚，吲哚在培养基中的积累可以由寇氏试剂（Kovacs’ reagent）检测出来。试验操作必须在48小时内完成，否则吲哚进一步代谢，会导致假阴性的结果。

寇氏试剂包含三种成分--盐酸、异戊醇和对二甲基氨基苯甲醛，每种试剂均有其作用；醇用于浓缩分散在培养基中的吲哚；对二甲基氨基苯甲醛可以和吲哚反应形成红色的化合物，该反应必须在酸性条件下完成，盐酸的作用就是制造酸性环境。一旦指示剂的颜色变为红色，就表明吲哚试验为阳性（＋）。

实验步骤：

a．  在两支装有试验用培养基的试管上标记好试验菌名称，另一管作为对照。

b．  按照无菌操作，接种于试验菌培养基中。

c．  37℃培养48小时后，取出试验管， 每管加入10滴寇氏试剂，在手掌中搓动试管，使管内液体混合均匀，置于试管架上5分钟后，观察，寇氏试剂由黄色转为红色表示有吲哚存在，为试验阳性（＋）。

d．  记录试验结果。

 

（二）甲基红试验

大肠杆菌和产气杆菌利用葡萄糖时有所不同，大肠杆菌接种到诸如MRVP培养基中时，将产生一些酸性物质，导致pH下降。而产气杆菌利用葡萄糖时则产生中性物质，培养基的pH没有显著变化。

实验步骤：

a．  在两支装有试验用培养基的试管上标记好试验菌名称，另一管作为对照。

b．  按照无菌操作，接种于试验菌培养基中。

c．  37℃培养48小时后，取出试验管。取两个空试管， 每管加入5mL培养基（此时无须无菌操作）。再加入5滴甲基红试剂，若甲基红试剂由黄色转为红色表示培养基为酸性，为试验阳性（＋）。

d．  记录实验结果。

 

（三）V-P试验

产气杆菌利用葡萄糖时则产生的中性物质之一就是乙酰甲基甲醇，大肠杆菌并不产生此物质。V-P试验即是用于特异性地检测乙酰甲基甲醇的。V-P试验和甲基红试验一起，是检测大肠杆菌和产气杆菌的最有效的方法。

实验步骤：

a．  在两支装有试验用培养基的试管上标记好试验菌名称，另一管作为对照。

b．  按照无菌操作，接种于试验菌培养基中。

c．  37℃培养48小时后，取出试验管。加入0.5 mlα-萘酚溶液以及0.5 ml 40% KOH，静置5分钟，若管内颜色转为红色为V-P试验阳性（＋），如果所有试管均无红色产生，应稍为加热后，再看试验结果。

d．  记录实验结果。

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（四）枸橼酸盐利用试验

另一个可以区分大肠杆菌和产气杆菌的培养基是枸橼酸盐琼脂。若以枸橼酸盐作为唯一的碳源制备培养基，大肠杆菌不能在上面生长，而产气杆菌却可以生长得特别好。而且产气杆菌代谢产生的终产物为碱性，最终导致培养基pH 的显著上升。指示剂溴百里酚篮（brom thymol blue）可以检测到这一变化，pH中性时溴百里酚篮为绿色，当pH达到7.6时，颜色转为深蓝。除此之外，枸橼酸盐利用试验也可以用于某些肠道致病菌的检查。大多数的沙门氏菌可以利用枸橼酸盐，但是伤寒沙门氏菌和所有志贺氏菌却不利用。

实验步骤：

a．  在3支装有试验用西蒙氏培养基的试管上标记好试验菌名称，另一管作为对照；

b．  按照无菌操作，接种于试验菌培养基中。

c．  37℃培养48小时后，取出试验管，观察，若管内颜色转为深蓝色为枸橼酸盐利用试验阳性（＋），若试管仍为绿色，为试验阴性（－）。

d．  记录实验结果。

 

三、明胶液化试验

异养型微生物依赖于周围环境的有机物生长，而许多有机物由于分子量太大、结构过于复杂，不能被微生物吸收利用。有些微生物可以分泌水解性酶类到细胞外，在体外将大分子有机物分解为它们的结构单元或亚基，再加以吸收利用。不同类型的异养微生物可以水解的有机物是不同的，借此可以对微生物进行分类鉴定。

蛋白质是氨基酸的多聚物，蛋白质如明胶的水解过程为：

明胶à朊蛋白à蛋白胨à多肽à氨基酸

明胶酶是有些微生物分泌的一种蛋白酶，催化蛋白质分解。明胶液化试验用于判断微生物是否具有分解蛋白质的能力。将待检微生物穿刺接种于明胶培养基，经过培养，如细菌分解明胶就会发生明胶液化现象。

1．实验材料

（1）细菌：枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面培养物。

（2）试剂：淀粉琼脂平板、碘试剂、明胶高层培养基。

（3）其它：接种环。

2．实验方法

（1） 取明胶高层培养基三支，通过穿刺接种法，一支接种大肠杆菌，另一支接种枯草杆菌，余下一支为对照。

（2） 置37℃恒温箱中培养24～48小时。

（3） 将试管置于冰箱或冰浴中30～60分钟。

（4） 观察结果，明胶培养基呈液化状态者为阳性（＋）；无液化现象发生者则为阴性（－）。

 

四、硫化氢产生试验

硫化氢（Hydrogen sulfide，HAS）是某些微生物在分解半胱氨酸等含硫氨基酸时脱硫产生的。硫化氢的产生是半胱氨酸转化为丙酮酸和氨这一系列反应的第一步，可以由醋酸铅检测出来，硫化氢遇到醋酸铅，可以形成黑色的沉淀。

1．实验材料

（1）细菌：大肠杆菌培养物；普通变形杆菌培养物；枯草杆菌培养物；梭杆菌培养物。

（2）试剂：醋酸铅营养琼脂高层；过氧化氢溶液（3～10％）。

（3）其它：接种针；灭菌牙签；灭菌枪头；载玻片；体视镜等。

2．实验方法

（1） 使用接种针。按照无菌操作，将细菌接入醋酸铅琼脂高层。一支穿刺接种甲型副伤寒杆菌，另一支穿刺接种乙型副伤寒杆菌，注明菌名。

（2） 置37℃恒温箱中培养24～48小时。

（3） 培养结束后，观察结果时，有黑褐色硫化铅者为阳性（＋），无此现象者为阴性（－）。

（4） 记录实验结果。

 

【附录】上述生理生化反应有关培养基与试剂

一、培养基

1．糖发酵培养基

（1） 制备“蛋白胨-水”培养基（蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH7.6）备用。

（2） 配制各种单糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖共5种）的20%水溶液，0.56~0.7kg/cm²高压灭菌20分钟。

（3） 取上述蛋白胨-水培养基100ml，加1.6%溴甲酚紫0.1ml，混匀，分装于小试管中，内倒置一杜氏小管，0.56~0.7kg/cm²高压灭菌，以无菌操作加入相应的灭菌单糖溶液于每管中，使最终浓度为0.5~1.0%。

2．“磷酸盐-葡萄糖-蛋白胨-水”培养基（甲基红-VP试验培养基）

蛋白胨	0.5g
磷酸氢二钾	0.5g
葡萄糖	0.5g
蒸馏水	100ml
pH	7.2~7.6
0.56~0.7kg/cm2高压灭菌20分钟

3．枸橼酸盐琼脂培养基

枸橼酸钠（无水）	0.2 g
氯化钠	0.5 g
硫酸镁	0.02 g
磷酸氢二钾	0.1 g
磷酸二氢铵	0.1 g
琼脂	2 g
蒸馏水	100ml

以上成分加热融化，调pH至6.8~7.0，加入1%溴麝香草酚蓝1 ml，混匀，分装试管，经0.7kg/cm²高压灭菌20~30分钟后制成斜面即可。

4．蛋白胨-水培养基（吲哚试验用）

蛋白胨	1 g
氯化钠	0.5 g
蒸馏水	100ml
pH	7.2~7.4
1 kg/cm2高压灭菌20分钟

5．醋酸铅培养基

1.5~2.0%普通肉汤琼脂培养基	100 ml
硫代硫酸钠	0.25 g
10 %醋酸铅溶液	1 ml

将琼脂培养基加热融化，冷却至约60℃，加入硫代硫酸钠，混合，高压灭菌。冷却至约50℃，无菌操作加入醋酸铅溶液，混匀，分装试管，每管3~5ml，直立待凝即可。醋酸铅溶液预先经0.56 kg/cm²高压灭菌15分钟。

6．明胶培养基

肉汤培养基100ml加入明胶12~18g，加热融化，分装试管，每管2~3ml，0.56 kg/cm²高压灭菌30分钟，最终pH为7.2~7.4，直立待凝。

二、试剂

1．甲基红试剂

取甲基红0.1克，溶于300ml 95%乙醇中，蒸馏水定容至500ml。

2．寇氏试剂

5.0g对二甲基氨基苯甲醛加至75 ml戊醇中，置50~60℃水浴中，搅拌使之完全溶解，冷却，将25 ml浓盐酸一滴滴徐徐加入，边加边摇，配制后装棕色瓶并放暗处保存.。