[推荐]微生物与发酵工艺知识大全

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1、初级代谢的代谢变化
　　初级代谢是生物细胞在生命活动过程中所进行的代谢活动，其产物即为初级代谢产物。发酵中的菌体、基质和产物三者变化的基本过程是：菌体进入发酵罐后就开始生长、繁殖，直至一定的菌体浓度。其生长过程仍显示停滞期、对数期、稳定期和衰亡期等生长史的特征。但在发酵过程中，即使同一菌种，由于菌体的生理状态与培养条件的不同，各个时期时间长短也不尽相同。如停滞期的长短就随培养条件而有所不同，并与接种菌的生理状态有关。对数期的菌种移植到与原培养基组成完全相同的新培养基中，就不会出现停滞期，仍以对数期的方式继续繁殖下去。另外，用稳定期以后的菌体接种，即使接种的菌体全部能够生长，也要出现停滞期。因此，工业发酵中往往要接入处于对数期(特别是中期)的菌体，以尽量缩短停滞期。为了获得代谢产物，菌体尚未达到衰亡期即行放罐处理。随着菌体生长繁殖和产物的形成，基质(如葡萄糖)浓度的变化一般是随发酵时间的延长而不断下降，溶解氧浓度也随发酵过程变化而发生变化。初级代谢产物由于没有明显的生产期，所以它是随菌体生长在不断地生成的，有的与菌体生长成平行关系，如乳酸、醋酸、氨基酸和核酸等。

图7-1谷氨酸发酵的代谢曲线
　　图7-1表示初级代谢产物谷氨酸发酵过程的代谢变化。变化的根本原因在于菌体的代谢活动引起环境的变化，而环境的变化又反过来影响菌体的代谢。在发酵初期种子刚接入发酵罐中，菌体处于停滞期，以适应新的环境。细胞进行呼吸作用，利用贮存物质合成大分子物质和所需的能量，菌体个体长大，但没有分裂，此时糖等基质基本不消耗或很少消耗，pH值稍有上升是尿素被分解放出氨所致。菌体经过停滞期之后就开始繁殖，并很快进入对数期，代谢逐渐旺盛，菌体大量繁殖，个体生长和群体繁殖循环交替进行，培养物的混浊度(以光密度表示)与菌体增殖情况基本一致，OD值(光密度)直线增长，菌体形态与二级种子相同，绝大多数为“V”形分裂。耗糖速度加快，糖作为碳源和能源用于合成细胞成分和合成反应所需要的能量。尿素被脲酶分解放出氨使pH值上升，氨被菌体利用可使pH值下降，这时需及时补加尿素，补充氮源和调节pH值。由于菌体代谢活动放出热，温度开始上升，一般发酵5h左右温度上升，应注意降温。由于菌体不断增加，代谢旺盛，产生CO2，排气中CO2浓度显著增加。耗氧量很快增加，培养基中的溶解氧下降，排气中的O2浓度也下降，应根据情况提高风量，特别是在对数期的末期，应注意风量，促进菌体转化。此时为长菌阶段，极少产谷氨酸，控制发酵条件以有利于长菌。但在对数期的末期要加大风量，供给充足的氧，并及时流加尿素，供给充分的氮源，促进增殖型菌体向生产型菌体转化。在生物素限量的情况下，部分菌体内的生物素含量由“丰富转向贫乏”，此部分菌就停止繁殖，在条件适宜时，开始伸长、膨胀，形成生产型细胞，开始积累谷氨酸。但是由于菌体增殖并非完全同步，还有部分菌体为增殖型，这是菌体由增殖型向生产型转化的时期，约需10～18h。在此期间，菌体数量达到最大值，培养液的OD值与菌体增殖不一致，OD值除反映菌体增殖外，还反映了菌体的伸长、膨胀。这是代谢最旺盛的时期，耗糖加快，谷氨酸生成迅速增加，耗氧速率加快，并接近最大值。发酵控制方面必须充分供氧，风量达最大值，充分供给氮源。对发酵控制来讲，此时以前的控制是发酵成败的关键。此时期的变化受生物素和风量的明显影响。一般来说，加大风量对菌体的伸长、膨胀有促进作用。菌体完成由增殖型向生产型转化后，菌形几乎都伸长、膨胀、边缘不整齐、像花生型。大量积累谷氨酸，耗糖与产酸相适应，产酸达最大值，对糖的转化率达50％～56％，应继续流加尿素，保证充足的氮源，pH值维持7.0～7.2。为加快产酸速度，应适当提高温度，一般为36～37℃。根据菌体耗氧速率继续供氧，随着发酵的延长，糖已耗尽，产酸增加，菌体活力逐渐降低。发酵后期耗氧减少，可适当降低风量。流加尿素以少量为好，控制pH值6.8～7.0。当残糖降到1％，根据发酵情况可将风量降到最低，促进中间产物转向谷氨酸。

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1. 次级代谢的代谢变化

　　次级代谢产物包括大多数的抗生素(antibiotic)、生物碱(alkaloid)和微生物毒素(microbialtoxin)等物质。按动力学模型分类，它们的发酵属于菌体的生长与产物非偶联的类型，也就是说，菌体生长繁殖阶段(又称生长期)与产物生成阶段(又称生产期)是分开的。次级代谢的代谢变化（以抗生素发酵为代表）如图7-2所示，一般分为菌体生长、产物生成和菌体自溶三个阶段。

图7-2　抗生素发酵的代谢曲线
UAA—可利用的氨基酸；NH3N—氨基氮
　 ⒈菌体生长阶段
　 产生菌接种至发酵培养基后，在合适的培养条件下，经过一定时间的适应就开始生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度（菌体DNA含量达到定值，即不进行繁殖，细胞数量恒定，但多元醇、脂类等细胞内含物仍在积累，使菌体干重增加，此时开始合成产物，此刻的菌体浓度称为临界浓度）。其代谢变化主要是：碳源(包括糖类、脂肪等)和氮源等进行分解代谢，菌体进行合成代谢；结果是碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被消耗，浓度明显减少，而新菌体不断被合成，菌浓明显增加。随着菌浓不断增加，摄氧率也不断增大，溶氧浓度不断下降。当菌浓达到临界值时，溶氧浓度降至最小。由于基质的代谢变化，pH值也发生一定改变，有时先开始下降，而后上升，这是糖代谢先产生酮酸等有机酸而后被利用的结果；有时先开始上升而后下降，这是菌体先以培养基中的氨基酸或尿素作为氮源而被利用，释放出氨，使pH值上升，而后氨又被利用使pH值下降的结果。
　 当营养物质消耗到一定程度，或者菌体达到一定浓度，或者供氧受到限制而使溶解氧浓度降到一定水平时，其中某一参数可能成为菌体生长的限制性因素，使菌体生长速率减慢。同时，在大量合成菌体期间，积累了相当量的某些代谢中间体，原有酶的活力下降(或消失)，出现了与次级代谢有关的酶或其酶被解除了阻抑等原因，导致菌体的生理状态发生改变，发酵就从菌体生长阶段转入产物生成阶段。
　 这个阶段一般又称为菌体生长期或发酵前期，也有人称为平衡期。
　 ⒉产物生成阶段
　 这个阶段主要是合成次级代谢产物。在此期间，产物的产量逐渐增多，直至达到高峰，生产速率也达到最大，直至产物合成能力衰退。
如果以菌体DNA含量作为菌体生长繁殖的标准来划分菌体生长阶段(生长期)和产物生成阶段(生产期)，它们的阶段界限是很明显的，即菌体的生长达到恒定后(即DNA含量达到定值，菌体浓度达到临界浓度)就进入产物生成阶段，开始形成产物。
在这个阶段中，产生菌的呼吸强度一般无显著变化，菌体物质的合成仍未停止，使菌体的质量有所增加，但基本不繁殖。这个阶段的代谢变化是以碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主，碳、氮等营养物质不断被消耗，产物不断被合成。外界环境的变化很容易影响这个阶段的代谢，碳源、氮源和磷酸盐等的浓度必须控制在一定的范围内，发酵条件也要严格控制，才能促使产物不断地被合成。如果这些营养物质过多，则菌体就要进行生长繁殖，抑制产物的合成，使产量降低；如果过少，菌体就易衰老，产物合成能力下降，产量减少。发酵液的pH值、培养温度和溶氧浓度等参数的变化，对该阶段的代谢变化都有明显的影响，也须严格控制。
　 这阶段一般称为产物生产期或发酵中期。也有人把生产期划分为贮藏期和持续期，前者是细胞积累脂肪和糖，使干重继续增加，开始形成产物；后者是细胞干重不变，但继续耗糖和分泌产物。
　 ⒊菌体自溶阶段
　 这个阶段的菌体衰老、细胞开始自溶，氨基氮含量增加，pH值上升，产物合成能力衰退，生产速率下降。发酵到此期必须结束，否则产物不仅受到破坏，还会因菌体自溶而给发酵液过滤和提取带来困难。
　 这个阶段一般称为菌体自溶期或发酵后期。
　 根据发酵过程中的参数变化绘制出的次级代谢的代谢曲线，可清楚地说明过程中的代谢变化，并反映出碳源、氮源的利用和pH值、菌体浓度和产物浓度等参数之间的相互关系。分析研究代谢曲线，还有利于掌握发酵代谢变化的规律和发现工艺控制中存在的问题，有助于改进工艺，提高产物的产量。

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三、发酵过程的主要控制参数

　　微生物发酵是在一定条件下进行的，其代谢变化是通过各种检测参数反映出来的。特别是菌体生长代谢过程中pH值的变化，它是菌体生长和代谢的综合表现。一般发酵过程控制主要参数有以下几种。
　　⑴pH值(酸碱度)发酵液的pH值是发酵过程中各种生化反应的综合结果，它是发酵工艺控制的重要参数之一。pH值的高低与菌体生长和产物生成有着重要的关系。
　　⑵温度(℃)这是指发酵整个过程或不同阶段中所维持的温度。它的高低与发酵中的酶反应速率、氧在培养液中的溶解度和传递速率、菌体生长速率和产物生成速率等有密切关系。不同的菌种，不同产品，发酵不同阶段所维持的温度亦不同。
　　⑶溶氧浓度（DO值，简称溶氧）溶解氧是好氧菌发酵的必备条件。氧是微生物体内的一系列经细胞色素氧化酶催化产能反应的最终电子受体，也是合成某些代谢产物的基质，所以，溶氧大小的影响是多方面的。利用溶氧的变化，可了解产生菌对氧利用的规律，反映发酵的异常情况，也可作为发酵中间控制的参数及设备供氧能力的指标。溶氧一般用绝对含量(mg／L)来表示，有时也用在相同条件下氧在培养液中饱和度的百分数(％)来表示。
　　⑷基质含量　这是发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。它们的变化对产生菌的生长和产物的合成有着重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。因此，在发酵过程中，必须定时测定糖(还原糖和总糖)、氮(氨基氮或铵氮)等基质的浓度。
　　⑸空气流量　这是指每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，也可叫通风比，也是好氧发酵的控制参数。它的大小与氧的传递和其他控制参数有关，一般控制在0.5～1.0L／(L·min)。
　　⑹压力　这是发酵过程中发酵罐维持的压力。罐内维持正压可以防止外界空气中的杂菌侵入而避免污染，以保证纯种的培养。同时罐压的高低还与氧和CO2在培养液中的溶解度有关，间接影响菌体代谢。罐压一般维持在0.02～0.05MPa。
　　⑺搅拌转速　对好氧性发酵，在发酵的不同阶段控制发酵罐搅拌器不同的转数，以调节培养基中的溶氧。搅拌转速是指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每分钟的转数来表示。它的大小与氧在发酵液中的传递速率和发酵液的均匀性有关。
　　⑻搅拌功率　这是指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵液所消耗的功率(kW／m3)。它的大小与液相体积氧传递系数KLα有关。
　　⑼黏度　黏度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况，通常用表观黏度表示之。它的大小可改变氧传递的阻力，又可表示相对菌体浓度。
　　⑽浊度（OD值）　浊度是能及时反映单细胞生长状况的参数，用于澄清培养液中低浓度非丝状菌的测量，测得的OD值与细胞浓度成线性关系。一般采用分光光度计的波长420～660nm测量，要求吸光率0.3～0.5。波长600～700nm间，一个吸光率单位大约相当于1.5g细胞干重／L。浊度对氨基酸、核苷酸等产品的生产是极其重要的。
　　(11)料液流量　这是控制流体进料的参数。
　　(12)产物的浓度　这是发酵产物产量高低或合成代谢正常与否的重要参数，也是决定发酵周期长短的根据。
　　(13)氧化还原电位　培养基的氧化还原电位是影响微生物生长及其生化活性的因素之一。对各种微生物而言，培养基最适宜的与所允许的最大电位值，应与微生物本身的种类和生理状态有关。氧化还原电位常作为控制发酵过程的参数之一，特别是厌氧发酵和某些氨基酸发酵是在限氧条件下进行的，溶氧电极已不能精确使用，这时用氧化还原电位参数控制则较为理想。
　　(14)废气中的氧含量　废气中的氧含量与产生菌的摄氧率和KLα有关。从废气中的氧和CO2的含量可以算出产生菌的摄氧率、呼吸商和发酵罐的供氧能力。
　　(15)废气中的CO2含量　废气中的CO2就是产生菌呼吸放出的CO2。测定它可以算出产生菌的呼吸商，从而了解产生菌的呼吸代谢规律。
　　(16)菌丝形态　丝状菌发酵过程中菌丝形态的改变是生化代谢变化的反映。一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期长短的依据之一。
　　(17)菌体浓度（简称菌浓）　菌浓是控制微生物发酵的重要参数之一，特别是对抗生素次级代谢产物的发酵。它的大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响，因此测定菌体浓度具有重要意义。菌浓与培养液的表观黏度有关，间接影响发酵液的溶氧浓度。在生产上，常常根据菌浓来决定适合的补料量和供氧量，以保证生产达到预期的水平。
　 　根据发酵液的菌体量和单位时间的菌浓、溶氧、糖浓度、氮浓度和产物浓度等的变化值，即可分别算出菌体的比生长速率、氧比消耗速率、糖比消耗速率、氮比消耗速率和产物比生成速率。这些参数也是控制产生菌的代谢、决定补料和供氧工艺条件的主要依据，多用于发酵动力学的研究。
　 　除上述外，还有跟踪细胞生物活性的其他化学参数，如NAD-NADH体系、ATP-ADP-AMP体系、DNA、RNA、生物合成的关键酶等，需要时可查阅有关资料。

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第二节　温度对发酵的影响及其控制

一、温度对发酵的影响

　　微生物发酵所用的菌体绝大多数是中温菌，如霉菌、放线菌和一般细菌。它们的最适生长温度一般在20～40℃。在发酵过程中，需要维持适当的温度，才能使菌体生长和代谢产物的生成顺利地进行。
　 　温度对发酵有很大的影响。它会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制，影响发酵液的理化性质，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。
　 　温度对化学反应速度的影响常用温度系数（Q10）（温度每升高10℃，化学反应速度所增加的倍数）来表示。在不同温度范围内，Q10的数值是不同的，一般是2～3。而酶反应速度与温度变化的关系也完全符合此规律，也就是说，在一定范围内，随着温度的升高，酶反应速率也增加，但有一个最适温度，超过这个温度，酶的催化活力会下降。温度对菌体生长的酶反应和代谢产物合成的酶反应的影响往往是不同的。
　 　有人考察了不同温度(13～35℃)对青霉菌的生长速率、呼吸强度和青霉素生成速率的影响，结果是，温度对这三种代谢的影响是不同的。按照阿伦尼乌斯方程计算，青霉菌生长的活化能E=34kJ／mol，呼吸活化能E=71kJ／mol，青霉素合成的活化能E=112kJ／mol。从这些数据得知：青霉素生成速率对温度的影响最为敏感，微小的温度变化，就会引起生成速率产生明显的改变，偏离最适温度就会引起产物产量发生比较明显的下降，这说明次级代谢发酵温度控制的重要性。因此，温度对菌体的生长和合成代谢的影响是极其复杂的，需要考察它对发酵的影响。
　　温度还能改变菌体代谢产物的合成方向。如在高浓度Cl-和低浓度Cl-的培养基中利用金霉素链霉菌NRRLB-1287进行四环素发酵过程中，发酵温度愈高，愈有利于四环素的合成，30℃以下时合成的金霉素增多，在35℃时就只产四环素，而金霉素合成几乎停止。
　　温度变化还对多组分次级代谢产物的组分比例产生影响。如黄曲霉产生的多组分黄曲霉毒素，在20℃、25℃和30℃下发酵所产生的黄曲霉毒素(aflatoxin)G1与B1的比例分别为3:1、1:2、1:1。又如赭曲霉在10～20℃发酵时，有利于合成青霉素，在28℃时则有利于合成赭曲霉毒素A。这些例子，都说明温度变化不仅影响酶反应的速率，还影响产物的合成方向（当然，这也是酶反应）。据报道，温度还能影响微生物的代谢调控机制，在氨基酸生物合成途径中的终产物对第一个合成酶的反馈抑制作用，在20℃低温时就比在正常生长温度37℃时抑制更严重。
　　除上述直接影响外，温度还对发酵液的物理性质产生影响，如发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解吸收速率等，都受温度变化的影响，进而影响发酵动力学特性和产物的生物合成。

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二、影响发酵温度变化的因素

　　在发酵过程中，既有产生热能的因素，又有散失热能的因素，因而引起发酵温度的变化。产热的因素有生物热(Q生物)和搅拌热(Q搅拌)；散热因素有蒸发热(Q蒸发)、辐射热(Q辐射)和显热(Q显)。产生的热能减去散失的热能，所得的净热量就是发酵热[Q发酵，kJ／(m3·h)]，即Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射。这就是发酵温度变化的主要因素。现将这些产热和散热的因素分述如下。
　　⒈生物热(Q生物)
　　产生菌在生长繁殖过程中产生的热能，叫做生物热。营养基质被菌体分解代谢产生大量的热能，部分用于合成高能化合物ATP，供给合成代谢所需要的能量，多余的热量则以热能的形式释放出来，形成了生物热。
　　生物热的大小，是随菌种和培养基成分不同而变化。一般来说，对某一菌株而言，在同一条件下，培养基成分愈丰富，营养成分被利用的速度愈快，产生的生物热就愈大。生物热的大小还随培养时间不同而不同：当菌体处在孢子发芽和停滞期时，产生的生物热是有限的；进入对数期，就释放出大量的热能，并与细胞的生成量成正比；在对数期以后，热能就开始减少，并随菌体逐步衰老而下降。因此，在对数期释放的发酵热最大，常作为发酵热平衡的主要依据。例如，四环素发酵在20～50h时的发酵热最大，最高值达29330kJ／(m3·h)，其他时间的最低值约为8380kJ／(m3·h)，平均值为16760kJ／(m3·h)。另外，还发现抗生素高产量批次的生物热高于低产量批次的生物热。这说明抗生素合成时菌的新陈代谢十分旺盛。
　　生物热的大小与菌体的呼吸强度有对应关系，呼吸强度愈大，所产生的生物热也愈大。在四环素发酵中，这两者的变化是一致的，生物热的高峰也是碳利用速度的高峰。有人已证明，在一定条件下，发酵热与菌体的摄氧率成正比关系，即Q发酵=0.12。
　　⒉搅拌热(Q搅拌)
发酵罐搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量，即搅拌热。搅拌热可根据下式近似算出来。

式中P／V——通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率，kW／m3；
3600——热功当量，kJ／(kW·h)。
　　⒊蒸发热(Q蒸发)
　　空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后再排出，引起水分蒸发所需的热能，即为蒸发热。水的蒸发热和废气因温度差异所带的部分显热(Q显)一起都散失到外界。由于进入的空气温度和湿度是随外界的气候和控制条件而变，所以Q蒸发和Q显是变化的。
　　⒋辐射热(Q辐射)
　　由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热能通过罐体向大气辐射的热量，即为辐射热。辐射热的大小取决于罐内温度与外界气温的差值，差值愈大，散热愈多。
　　由于Q生物、Q蒸发和Q显，特别是Q生物在发酵过程中是随时间变化的，因此发酵热在整个发酵过程中也随时间变化，引起发酵温度经常波动。为了使发酵能在一定温度下进行，故要设法进行控制。

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三、温度的控制

　　⒈最适温度的选择
　　最适发酵温度是既适合菌体的生长、又适合代谢产物合成的温度。但最适生长温度与最适生产温度往往是不一致的。各种微生物在一定条件下，都有一个最适的温度范围。微生物种类不同，所具有的酶系不同，所要求的温度不同。同一微生物，培养条件不同，最适温度不同。如谷氨酸产生菌的最适生长温度为30～34℃，产生谷氨酸的温度为36～37℃。在谷氨酸发酵的前期菌生长阶段和种子培养阶段应满足菌体生长的最适温度。若温度过高，菌体容易衰老。在发酵的中后期菌体生长已经停止，为了大量积累谷氨酸，需要适当提高温度。又如初级代谢产物乳酸的发酵，乳酸链球菌的最适生长温度为34℃，而产酸最多的温度为30℃，但发酵速度最快的温度最高达40℃。次级代谢产物发酵更是如此，如在加有2％乳糖、2％玉米浆和适量无机盐的培养基中对青霉素产生菌产黄青霉进行发酵研究，测得菌体的最适生长温度为30℃，而青霉素合成的最适温度仅为24.7℃。因此需要选择一个最适的发酵温度。
　　最适发酵温度随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。理论上，整个发酵过程中不应只选一个培养温度，而应根据发酵不同阶段，选择不同的培养温度。在生长阶段，应选择最适生长温度；在产物生成阶段，应选择最适生产温度。发酵温度可根据不同菌种，不同产品进行控制。
　　有人试验青霉素变温发酵，其温度变化过程是，起初5h，维持在30℃，以后降到25℃培养35h，再降到20℃培养85h，最后又提高到25℃，培养40h放罐。在这样条件下所得青霉素产量比在25℃恒温培养提高了14.7％。又如四环素发酵，在中后期保持稍低的温度，可延长产物生产期，放罐前的24h，培养温度提高2～3℃，就能使最后这一天的发酵单位增加率提高50％以上。这些都说明变温发酵产生的良好结果。但在工业发酵中，由于发酵液的体积很大，升降温度都比较困难，所以在整个发酵过程中，往往采用一个比较适合的恒定培养温度，使得到的产物产量最高，或者在可能条件下进行变温发酵。实际生产中，为了得到较高的发酵效率，获得满意的产物得率，往往采用二级或三级管理温度。
　　⒉温度的控制
　　工业生产上，所用的大发酵罐在发酵过程中一般不需要加热，因发酵中释放了大量的发酵热，而需要冷却的情况较多。利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇形管中，通过热交换来降温，保持恒温发酵。如果气温较高(特别是我国南方的夏季气温)，作为冷却水的地表水温度又高，致使冷却效果很差，达不到预定的温度，须采用冷冻盐水进行循环式降温，以迅速降到最适发酵温度。因此大工厂需要建立冷冻站，提高冷却能力，以保证发酵在最适温度下进行。

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第三节pH值对发酵的影响及其控制
一、pH值对发酵的影响

　　发酵培养基的pH值，对微生物生长具有非常明显的影响，也是影响发酵过程中各种酶活的重要因素。pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：①影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；②影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄；③影响培养基中某些组分的解离，进而微生物对这些成分的吸收；④pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。
　　培养基中营养物质的代谢，是引起pH值变化的主要原因，发酵液pH值的变化乃是菌体代谢的综合效果。由于pH值不当，可能严重影响菌体的生长和产物的合成，因此对微生物发酵来说有各自的最适生长pH值和最适生产pH值。各种不同的微生物，对pH值的要求不同。多数微生物生长都有最适pH值范围及其变化的上下限：上限都在8.5左右，超过此上限，微生物将无法忍受而自溶；下限以酵母为最低(2.5)。但菌体内的pH值一般认为是中性附近。pH值对产物的合成有明显的影响，因为菌体生长和产物合成都是酶反应的结果，仅仅是酶的种类不同而已，因此代谢产物的合成也有自己最适的pH值范围，如合成青霉素的最适pH值范围为6.5～6.8。这两种pH值的范围对发酵控制来说都是很重要的参数。另外，pH值还会影响某些霉菌的形态。
　　一般认为，细胞内的H＋或OH－能影响酶蛋白的解离度和电荷情况，改变酶的结构和功能，引起酶活性的改变。但培养基的H＋或OH－并不是直接作用在胞内酶蛋白上，而是首先作用在胞外的弱酸(或弱碱)上，使之成为易于透过细胞膜的分子状态的弱酸(或弱碱)，它们进入细胞后，再行解离，产生H＋或OH－，改变胞内原先存在的中性状态，进而影响酶的结构和活性。所以培养基中H＋或OH－是通过间接作用来产生影响的。pH值还影响菌体对基质的利用速率和细胞的结构，影响菌体的生长和产物的合成。Collnig等人发现产黄曲霉的细胞壁的厚度就随pH值的增加而减小：其菌丝直径在pH6.0时为2～3μm；pH7.4时为2～18μm，并呈膨胀酵母状；pH值下降后菌丝形态又会恢复正常。pH值还影响菌体细胞膜的电荷状况，引起膜透性发生改变，因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成等。
　　如同温度对发酵影响一样，pH值对产物稳定性也有影响。如在β-内酰胺抗生素沙纳霉素(thienamycin)的发酵中，考察pH值对产物生物合成的影响时，发现pH6.7～7.5之间，抗生素的产量相近，高于或低于这个范围，合成就受到抑制。在这个pH值范围内，沙纳霉素的稳定性未受到严重影响，半衰期也无大的变化；但pH>7.5时，稳定性下降，半衰期缩短，发酵单位也下降。青霉素在碱性条件下发酵单位低，也与青霉素的稳定性有关。
　　由于pH值的高低对菌体生长和产物的合成产生明显的影响，所以在工业发酵中，维持最适pH值已成为生产成败的关键因素之一。

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二、发酵过程pH值的变化
　　在发酵过程中，pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。在产生菌的代谢过程中，菌体本身具有一定的调整周围环境pH值，构建最适pH值的能力。曾以产生利福霉素SV的地中海诺卡菌进行发酵研究，采用pH值为6.0、6.8、7.5三个出发值，结果发现pH值在6.8、7.5时，最终发酵pH值都达到7.5左右，菌丝生长和发酵单位都达到正常水平；但pH值为6.0时，发酵中期pH值只达4.5，菌浓仅为20％，发酵单位为零。这说明菌体仅有一定的自调能力。
　　培养基中的营养物质的代谢，也是引起pH值变化的重要原因，发酵所用的碳源种类不同，pH值变化也不一样。如灰黄霉素发酵的pH值变化，就与所用碳源种类有密切关系，如以乳糖为碳源，乳糖被缓慢利用，丙酮酸堆积很少，pH值维持在6～7之间；如以葡萄糖为碳源，丙酮酸迅速积累，使pH值下降到3.6，发酵单位很低。
发酵液的pH值变化是菌体代谢反应的综合结果。从代谢曲线的pH值变化就可以推测发酵罐中的各种生化反应的进展和pH值变化异常的可能原因。在发酵过程中，要选择好发酵培养基的成分及其配比，并控制好发酵工艺条件，才能保证pH值不会产生明显的波动，维持在最佳的范围内，得到良好的结果。实践证明，维持稳定的pH值，对产物的形成有利。

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三、发酵pH值的确定和控制
　　⒈发酵pH值的确定
　　微生物发酵的最适pH值范围一般是在5～8之间，如谷氨酸发酵的最适pH值为7.5～8.0。但发酵的pH值又随菌种和产品不同而不同。由于发酵是多酶复合反应系统，各酶的最适pH值也不相同，因此，同一菌种，生长最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的。例如，黑曲霉pH2～3时合成柠檬酸，在pH值接近中性时积累草酸。谷氨酸生产菌在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下形成谷氨酰胺。谷氨酸发酵在不同阶段对pH值的要求不同，发酵前期控制pH7.5左右，发酵中期pH7.2左右，发酵后期pH7.0，在将近放罐时，为了后工序提取谷氨酸，pH6.5～6.8为好。如初级代谢产物丙酮丁醇的梭状芽孢杆菌发酵，pH值在中性时，菌种生长良好，但产物产量很低，实际发酵最适pH值为5～6。次级代谢产物抗生素的发酵更是如此，链霉素产生菌生长的最适pH值为6.2～7.0，而合成链霉素的最适pH值为6.8～7.3。因此，应该按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH值范围，使产物的产量达到最大。
　　最适pH值是根据实验结果来确定的。将发酵培养基调节成不同的出发pH值进行发酵，在发酵过程中，定时测定和调节pH值以维持出发pH值，或者利用缓冲液配制培养基来维持之。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH值为菌体生长的最适pH值。以同样的方法，可测得产物合成的最适pH值。但同一产物的最适pH值，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。如合成青霉素的最适pH值，先后报告有7.2～7.5、7.0左右和6.5～6.6等不同数值，产生这样的差异，可能是所用的菌株、培养基组成和发酵工艺不同引起的。在确定发酵最适pH值时，要不定期考虑培养温度的影响，若温度提高或降低，最适pH值也可能发生变动。

生态无极

⒉pH值的控制
　　在各种类型的发酵过程中，实验所得的最适pH值、菌体的比生长速率(μ)和产物比生成速率(Qp)等3个参数的相互关系有四种情况(见图7-3)：①第一种情况是μ和Qp的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范围内(a)，这种发酵过程易于控制；②第二种情况是Qp(或μ)的最适pH值范围很窄，而μ(或Qp)的范围较宽(b)；③第三种情况是μ和Qp对pH值都很敏感，它们的最适pH值又是相同的(c)，第二、第三种情况的发酵pH值应严格控制；④第四种情况更复杂，μ和Qp有各自的最适pH值(d)，应分别严格控制各自的最适pH值，才能优化发酵过程。

图7-3pH值与比生长速率(μ)和比生成速率(Qp)之间的四种关系
　　在了解发酵过程中最适pH值的要求之后，就要采用各种方法来控制。首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。因为培养基中含有代谢产酸[如葡萄糖产生酮酸、(NH4)2SO4]和产碱(如NaNO3、尿素)的物质以及缓冲剂(如CaCO3)等成分，它们在发酵过程中要影响pH值的变化，特别是CaCO3能与酮酸等反应，而起到缓冲作用，所以它的用量比较重要。在分批发酵中，常采用这种方法来控制pH值的变化。
　　利用上述方法调节pH值的能力是有限的，如果达不到要求，可以用在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控制，特别是补料的方法，效果比较明显。过去是直接加入酸(如H2SO4)或碱(NaOH)来控制，但现在常用的是以生理酸性物质[(NH4)2SO4]和碱性物质(如氨水、尿素)来控制。它们不仅可以调节pH值，还可以补充氮源。当发酵的pH值和氨氮含量都低时，补加氨水，就可达到调节pH值和补充氨氮的目的；反之，pH值较高，氨氮含量又低时，就补加(NH4)2SO4。在加多了消泡剂(如豆油)的个别情况下，还可采用提高空气流量来加速脂肪酸的代谢，以调节pH值。通氨一般是使压缩氨气或工业用氨水(浓度20％左右)，采用少量间歇添加或连续自动流加，可避免一次加入过多造成局部偏碱。氨极易和铜反应产生毒性物质，对发酵产生影响，故需避免使用铜制的通氨设备。
　　目前，已比较成功地采用补料的方法来调节pH值，如氨基酸发酵采用流加尿素[(NH2)2CO]的方法，特别是次级代谢产物抗生素发酵，更常用此法。这种方法，既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。也就是说，采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性(如菌浓等)等几个目的。最成功的例子就是青霉素的补料工艺，利用控制葡萄糖的补加速率来控制pH值的变化范围(现已实现自动化)，其青霉素产量比用恒定的加糖速率和加酸或碱来控制pH值的产量高25％。