菌种生产中应注意啥

luzhln

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    一、引进母种注意事项。一是要在那些正规的、信得过的科研单位和菌种生产厂家引进，菌种质量才有保障；二是要明确菌种的特征特性，适宜出菇的温度范围，做到心中有数，适时投料播种；三是引进菌种后，要作出菇试验，检验菌种的适应性，确保规模生产时万无一失；四是有些品种在冰箱中保藏后，需转管复壮后再扩接原种，否则，菌种很难成活。据试验，鸡腿菇、姬松茸、大球盖菇、金针菇、木耳类等品种，最好是经复壮后再扩接原种更为保险。　　二、培养料配方要合理。无论是生产原种还是栽培种，原辅料的比例一定要准确无误，培养料的碳氮比值要合理，特别要控制氮元素的比例不能超标，否则，装瓶(袋)后，游离氨在瓶、袋内无法排除，菌丝将无法定植生长，导致菌种生产失败。　　三、灭菌要彻底，接种应无菌。菌种培养基用常压灭菌应在100℃下保持8－10小时，高压灭菌达到1.5公斤/平方厘米后保持1.5小时以上。接种时，应严格在无菌条件下操作。　　四、发菌阶段的控温。高温季节生产菌种，控制料温升高是重要一环。一是接种应在早晚温度较低时进行。二是摆放菌种时，瓶(袋)与瓶之间均应留有空隙，有利散热。如瓶、袋紧靠，势必导致高温烧菌，菌丝生长发育受阻，稀疏无力。三是培养室应择通风良好的房间，温度高时可随时通风降温。四是瓶、袋上面切忌覆盖，更
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仙人掌

说的好，下边还有呢…………

孔令东

很好呀，可惜没有说完呀。[em10]

luzhln

对不起，我还没有注意到，还是大家仔细。学习！学习！致敬！！
接上，，，，，，四是瓶、袋上面切忌覆盖，更不可堆码过高，否则，对散热极为不利。

仙人掌

不用客气，我们贵宾勤奋的很，发的帖子多了，挂万漏一是难免的，人非圣贤啊！~~

小蘑菇

说的很好。菌种生产实质是扩大繁殖的过程，所以应在扩大数量的基础上，保证质量的稳定性。配料、灭菌、接菌、养菌是重要的环节，分别注意料的配比、灭菌的彻底、接菌和养菌时的无菌操作。

小蘑菇

原种应该在正规厂家购买，不应该自制，意义不大。

小蘑菇

一种测试菌种活性的方法

1、）纤维素CMC酶 1.0标题 用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围 生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理 纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂 4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5－二硝基水杨酸 4.4无水葡萄糖 4.5四水酒石酸钾钠(分析纯) 4.6氢氧化钠(分析纯) 4.7重蒸苯酚(分析纯) 4.8无水亚硫酸钠(分析纯) 4.9叠氮化钠(分析纯) 4.10羧甲基纤维素钠 5.0仪器 5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃ 5.3 722型分光光度机计 5.4分析天平感量0.1㎎ 5.5一级玻璃制品 5.6电冰箱 6．0试剂的准备 6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8） 溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。 6.2 DNS试剂: 溶液A:称分析纯NaoH104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A、B溶液混合，加入1200ml水，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。 6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。 70标准曲线制作： 780℃7确称取1.000g1000ml10mg4℃冷藏备用。 7.3标准葡萄糖曲线制作 取1mg/ml标准葡萄糖液各0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml补加水至2.0ml,加入2.0mlDNS试剂,具塞,沸水浴中加热10分钟,冷却后定容至15ml,分光光度计550nm波长下测OD值,3次重复实验的均值用最小乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程。由光密度值引得葡萄糖量。 8.0 CMC酶活性测定。 8.1活性定义：1g酶粉（1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液产生1µg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个CMC酶活力单位。 8.2分析程序： 取三支15ml刻度试管分别加入0.2ml稀释酶液，在分别吸取1.8mlCMC溶液,50℃水浴保温30分钟,空白样用0.2ml稀释酶液,加入1.8ml醋酸缓冲液,同样50℃水浴30分钟,再吸取DNS2ml摇匀后,具塞,沸水浴反应10分钟,冷却后,补加水至15ml,轻轻上下摇匀,用空白调零点,于550nm下测OD值。 9.0计算活力单位

A×D×5×1000

CMC酶活力=————————µ/g(ml)

30 A：OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量（） D：酶粉（液）稀释倍数

小蘑菇

食用菌菌种保藏技术

菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。 　　一、菌种保藏原理 　　菌种保藏的方法很多，但原理大同小异。首先要挑选优良纯种。利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。不管采用哪种保藏方法，在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。 　　二、菌种保藏的方法 　　1、低温定期移植保藏法。将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3-5℃低温干燥处或4℃冰箱、冰柜中保藏，每隔4-6个月时间移植转管一次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境温度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的硫酸纸或牛皮纸包扎棉塞，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。除草菇菌种外，其他食用菌菌种都能采用此法保藏。 　　2、液体石蜡保藏法。取化学纯液体石蜡（要求不含水分、不霉变）装于三角瓶中加棉塞并包纸，在1公斤/平方厘米压力下灭菌1小时，再放入40℃恒温箱中数天，以蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28-30℃下培养2-3天，证明无杂菌生长方可使用。然后用无菌操作的方法把液体石蜡注入待保藏的斜面试管中。注入量以高出培养基斜面1-1.5厘米，塞上橡皮塞，用固体石蜡封口，直立于低温干燥处保藏。保藏时间在一年以上，在低温下，保藏时间还可延长。 　　3、沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，再用10%盐酸浸泡2-4小时，除去其中有机物质，再用水冲洗至流水的pH达到中性，烘干备用。同时取贫脊土或菜园土用水浸泡，使呈中性，沉淀后弃去上清液，烘干碾细，用100目筛子过筛，将处理好的沙与土以（2-4）:1混匀，用磁铁吸出其中的铁质，然后分装小试管或安瓿内，每管装量0.5-2克，塞棉塞，用纸包扎灭菌（1.5公斤/平方厘米，1小时），再干热灭菌（160℃，2-3小时）1-2次，进行无菌检验，合格后使用。将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3-5毫升，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气数小时，至沙土干燥为止。真空干燥操作需在孢子接入后48小时内完成，以免孢子发芽。制备好的沙土管用石蜡封口，在低温下可保藏2-10年。 　　4、滤纸片保藏法。取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）滤纸，剪成4×0.8厘米的小纸条，平铺在培养皿中用纸包裹进行灭菌（1公斤/平方厘米，30分钟）。采用钩悬法收集孢子，让孢子落在滤纸条上。将载有孢子的滤纸条放入保藏试管中，再将保藏试管放入干燥器中1-2天，除去滤纸水分，使滤纸水分含量达2%左右，然后低温保藏。 　　5、自然基质保藏法 　　⑴麦粒保藏法：取无瘪粒、无杂质的小麦淘洗干净，浸泡12-15小时，加水煮沸15分钟，继续热浸15分钟，使麦粒胀而不破，沥干水分摊开晾晒，使麦粒的含水量在25%左右。将碳酸钙、石膏拌入熟麦粒中（麦粒、碳酸钙、石膏比例为10公斤:133克:33克），拌和均匀后装入试管中，每管约2-3克，然后清洗试管，塞棉塞，灭菌1.5（1.5公斤/平方厘米，2小时），经无菌检查合格后备用，试管基质冷却后接种，适温培养，待菌丝长满基质后用石蜡涂封棉塞，放低温保藏。2年左右转接一次。 　　⑵麸曲保藏法。取新鲜麸皮，过60目筛除去粗粒。将麸皮和自来水按1:1拌匀，装入小试管，每管约装1/3高度，加棉塞用纸包扎，高压灭菌（1.5公斤/平方厘米，30分钟），经无菌检查合格后备用，将生长在斜面培养基上的健壮菌种，移种至无菌麸曲管中，移种时注意尽管捣匀小试管中的麸皮，呈疏松状态，在适温下培养至菌丝长满麸皮为止，将麸曲小管置干燥器中，在低温或适温下保藏。 　　6、生理盐水保藏法。取纯氯化钠0.7-0.9克，放入100%毫升蒸馏水中，搅拌均匀分装试管，每管5-10毫升，进行灭菌（1公斤/平方厘米，30分钟），经无菌检查合格后备用，将待保藏的菌种接入马铃薯葡萄糖液体培养基中适温振荡培养5-7天。无菌操作吸取少许培养菌种注入经检验合格的生理盐水试管中，塞上无菌橡皮塞，用石蜡涂封，在室温或低温保藏。 　　7、冷冻真空干燥法。将已培养、生长丰富的菌体或孢子悬浮于灭菌的血清、卵白、脱脂奶制成菌悬液，将悬液以无菌操作分装于灭菌的玻璃安瓿瓶中，每管约0.3-0.5毫升，然后用耐压橡皮管与冷冻干燥装置连接，安瓿瓶放在冷冻槽中于-30℃至-40℃迅速冷冻，并在冷冻状态下抽空干燥，并在真空状态下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本较高。 　　8、液氮超低温保藏法。首先将要保藏的菌种制成菌悬液备用；其次，准备安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷冻保护剂10%（体积比）甘油蒸馏水溶液，塞棉塞灭菌（1公斤/平方厘米，5分钟）。无菌检查后，接入要保藏的菌种，火焰熔封瓶口，检查是否漏气，将封好口的安瓿瓶放在冻结器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使保藏品逐步均匀地冻结，直至-35℃，以后冻结速度就不需控制，安瓿冻结后立即放入液氮罐内，在-150至-196℃保藏，该法只有少数科研院所使用。

小蘑菇

菌种质量鉴定与复壮

一、菌种质量标准 １、一级种（俗称母种）：在同一种培养基上具有原菌株的菌落形态特征，无病虫杂菌，菌丝洁白，生长健壮有力，边缘整齐，不发黄，不老化，菌龄掌握在刚长满斜面即用于扩接原种或继代培养。 ２、二级种（俗称原种）：无感染病虫杂菌，菌丝洁白，粗壮浓密，均匀布满瓶周，外见颜色一致，无不均匀斑，培养基由棕黑色转为淡棕黄色，有蘑菇特有香味，菌丝不萎缩，不发黄，接种后应在40-50天长满瓶,菌龄掌握在菌丝长满瓶10天左右使用。 ３、三级种（俗称栽培种）：无感染病虫杂菌，菌丝洁白玉米黄，粗壮有力，均匀布满瓶周，外观颜色大体一致，无明显不均匀斑，培养基成淡棕黄色，有蘑菇特有香味，培养基不萎缩，不吐黄水，接种后菌丝应在30-45天长满瓶,菌龄掌握在菌丝长满瓶后15天内使用。 二、菌种质量鉴定： １、直接观察　首先用肉眼观察包装是否合乎要求，棉塞有无松动，试管、玻璃瓶或塑料袋有无破损，棉塞和试管、瓶或袋中有无病虫侵染，菌丝色泽是否洁白均匀，有无发生老化。然后在瓶塞边作深吸气，闻是否具有蘑菇菌种特有的香味，原种和栽培种可取出小块菌丝体观察其颜色和均匀度，并用手指捏料块检查含水量是否符合标准。 ２、显微镜检查　在载玻片上滴一滴蒸馏水，然后挑取少许菌丝置水滴上，让菌丝体充分展开，盖好盖玻片，再置显微镜下观察。也可通过菌丝体染色后镜检观察。蘑菇菌丝体应粗壮，菌丝节较长，呈分枝状，说明是正常菌种，如果菌丝节很短，分枝很浓密，菌丝较纤细，生长缓慢，一般为不正常菌种。 ３、菌丝生长速率测定 　　将所获的菌种，转接至PDA 培养皿中央, 待菌丝身皿边辐射蔓管时, 用直径0.5cm的打孔器,经灭菌后打取边缘菌丝,边同培养基重新接入PDA 培养皿中央进行培养,每隔24小时,测定菌落直径,直至菌落覆盖全皿为止,从而耱出菌丝平均生长速度。 ４、耐高温测定 　　先将母种试管数支置于24℃下培养,10天后取出部分试管置30℃下培养,24小时后再放回24℃下培养,经过高温的处理,如果菌丝仍然健壮,旺盛生长,则表明该菌种具有耐较高温度的优良特性,也可将母种试管移接至草基试管培养基中,置24℃下培养5天正常生长后,把试管置28℃下进行培养, 如果菌丝能较正常生长也表明该品种具有耐较高温度的优良特性。 ５、 吃料能力鉴定　将试管母种接入新鲜配制的装在试管中的粪草培养基中， 置24℃下进行培养,5天后观察菌丝生长情况,如果菌种块能很快萌发,并迅速向培养料中生长伸展,则说明该品种的吃料能力强;如果菌种萌发后生长缓慢, 迟迟不向四周和料层深处伸展,则表明该品种对培养料的适应能力差,是劣质菌种。 ６、生理特征测定　蘑菇菌种的生理特征测定包括酶活力测定和遗传分析两方面。酶活力测定主要是进行纤维素酶活力的测定，遗传分析主要是进行酯酶同工酶的检测，以及RAPD检测等,分析该品种的遗传物质是否保持原有品种的特征带,如果遗传分析发现主要标记酶带或扩增带发现变异说明该品种有可能出错或已发生变异, 是劣质菌种。