微生物常规鉴定技术

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11、三糖铁（TSI）琼脂试验fficeffice" />

　　试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养18~24h，观察结果。

　　本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

12、氨基酸脱羧酶的测定

    有些细菌含有氨基酸脱羧酶，使羧基释出，生成胺类和二氧化碳。此反应在偏酸的条件下进行。当培养基含胺类时呈碱性反应，使指示剂变色。

接种与观察结果：用幼龄培养液作为菌种，直接接种。接种后封油，对照管与测定管同时接种封油。肠肝菌科的细菌于37℃培养4天观察。当指示剂呈紫色或带红色调的紫色者为阳性，呈黄色者为阴性。对照管应呈黄色反应。

13、硫化氢（H₂S）试验

　　有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。

　　试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±1℃培养24~28h，培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；用管塞压住置36±1℃培养1~6天。纸条变黑为阳性。

14、柠檬酸盐或丙酸盐的利用

某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为碳源，及磷酸胺作为氮源，将柠檬酸分解为二氧化碳，则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性。

接种与观察结果：取幼龄菌种接种于斜面上，适温培养3－7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性。

15、利用丙二酸盐试验

丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶的抑制剂。能否利用丙二酸盐，也是细菌鉴定中的一个鉴别性特征。

许多微生物代谢有三羧酸循环，而琥珀酸脱氢是三羧酸循环的一个环节，丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶，与丙二酸不被分解，所以琥珀酸脱氢酶被占据，不能释放出来催化琥珀酸脱氢反应，抑制了三羧酸循环。

接种和观察结果：

用幼龄菌种接种测定培养基和空白培养基，于适温培养1－2d，观察培养基变色情况。

如测定培养基生长并变蓝色，表示可利用丙二酸盐，为阳性结果。反之，如测定培养基未变色，而空白对照培养基生长，则为阴性，即不利用丙二酸盐。

16、葡萄糖酸盐的氧化

假单胞菌属和肠道杆菌科的细菌，可氧化葡萄糖酸为2－酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸无还原性基团，氧化后形成酮基，则可将斐林氏试剂的呈蓝色的铜盐还原为砖红色的Cu₂O沉淀。

试验方法：用pH7.2的磷酸缓冲液配制成含1％葡萄糖酸盐（可用葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙）的溶液。分装试管，每管2mL。刮取适温培养18－24小时的菌苔至2mL的葡萄糖酸盐溶液中制成浓的菌悬液，置30℃过夜，然后每管加入0.5mL的斐林试剂，放在沸水浴中加热10分钟，试管中液体由蓝色变为黄绿，绿橙色或出现红色沉淀者为阳性反应，如溶液不变色者为阴性。

17、硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验

　　试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±1℃培养18~24h，观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10min，若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。

本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。

18、β-半乳糖苷酶（ONPG）的测定

本试验应用于肠肝菌科的鉴定。

测定步骤：

（1）    将测定菌接种于TSI斜面上，培养于37℃18h（或其他最适温度）

（2）    挑取1大环菌苔入约0.25mL的生理盐水中制成菌悬液，每管加1滴甲苯，摇匀（有助于酶的释放），于37℃放置5分钟。

（3）    在菌悬液中加入0.25mL的0.75mol/L ONPG，测定管置于37℃水浴培养。经30分、1、2、3、……24h进行观察，如有黄色者则为阳性。

19、耐盐性试验

本试验是观察渗透压对细菌生长的影响。由于不同菌类耐盐性不同，故常以此作为鉴别特征。一般可根据不同种类的菌株，选择其适合生长的培养基，在其中加入不同量的NaCl，接种后观察其生长与否，以判断其耐盐性。

以肉汤培养液根据鉴定需要，配成不同浓度的NaCl，如2％、3.5％、5％、7％、10％等。培养基要求十分澄清，接种时应采用幼龄菌液，直针接种，适温培养3－7d，与未接种的对照管对比，目测生长情况。

20、卵磷脂酶的测定

菌体如存在有卵磷脂酶，就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱。

接种与观察结果：将测试菌的菌液，环接在有卵黄的试管和不加卵黄的对照管中，适温培养1、3或5天观察。假若与对照管相比较，在卵黄胰胨液中或表面，形成白色沉淀者，则为阳性反应，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱，说明有卵磷酶的存在。

另一种方法：

以无菌操作取出卵黄，放入灭菌的三角瓶中，加相当于等量的生理盐水摇匀后，取10mL卵黄液加入到溶化的约50－55℃的200mL肉汁胨琼脂培养基中，混合均匀后倒入培养皿，制成卵黄平板，过夜后即可使用。

接种与观察结果：将测试菌点接在卵黄平板上，每皿可分散点接4－5株菌、（芽孢杆菌以点接1－2株菌为宜）以不影响结果观察为度，如测试厌氧菌，则须在上面加盖无菌的盖玻片。每株菌至少重复点接两皿。适温培养1－2d观察，在菌落周围形成乳白色混浊环，表示卵磷脂被分解，生成脂肪，说明该菌株有卵磷脂酶存在。

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21、石蕊牛奶的反应fficeffice" />

牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。

细菌对牛奶的作用有一下几种：

（1）    产酸――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。

（2）    产碱――细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。

（3）    胨化――细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比较澄清。

（4）    酸凝固――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变化，当酸度很高时，可使牛奶凝固。

（5）    凝乳酶凝固――有些细菌能产生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此时石蕊常呈蓝色或不变色。

（6）    还原――细菌生长旺盛，使培养基氧化还原电位降低，因此石蕊还原褪色。

接种与观察结果：接种待测菌株，适温培养3、5、7d或14d，按上述特征观察和记录牛奶产酸、产碱、凝固或胨化等反应。

22、酪素水解试验（酪蛋白水解）

牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3－5株菌。适温培养1、3、5天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。

配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固。

23、酪氨酸水解

将L－酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，8磅20分钟灭菌，然后于100mL无菌的营养肉汤琼脂混合，倾倒平板，待凝固后，将测试菌接种于平皿上，培养7到14d，记录酪氨酸结晶是否被水解而变透明。

24、苯丙氨酸脱氨试验

某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。

接种与观察结果：将菌种接种于该培养基斜面上，适温培养3－7d（某些芽孢杆菌须培养21d）。取10％的FeCl₃水溶液4－5滴，滴加在生长菌苔的斜面上，当斜面和试剂液面处呈蓝绿色时为阳性反应，表示从苯丙氨酸形成苯丙酮酸。

25、产糊精结晶试验

某些需氧芽孢杆菌能产生淀粉酶，使淀粉水解为糊精。该反应仅用于区别多粘芽孢菌，浸麻芽孢菌和环状芽孢菌的培养物。在大试管中（200X20mm）装碾过的小麦（或燕麦）0.5g，CaCO₃0.2g，蒸馏水10mL，灭菌后接种，35℃培养3、5和7d后，取1滴卢哥尔氏碘液混匀，干燥后，用显微镜观察有暗褐色或蓝色的六角形结晶的糊精，假若大量形成，则排列为扇形或针状。

26、从甘油产生二羟基丙酮

本试验主要是用于区分醋酸单胞菌属和假单胞菌属以及某些芽孢杆菌的鉴定。生酮反应是由相应的多元醇的脱氢酶的作用，此反应就是测定有否这些脱氢酶。

接种与观察结果：融化三角瓶中的培养基，倒成平板，凝固后在平板上划短线接种，适温培养10天，在平板上倒入斐林试剂A、B混合液，以覆盖菌落为度，2小时内检查，若在菌落周围出现红色的晕者为阳性反应。为了能掌握这一试验，可接种多粘芽孢杆菌作阳性对照。

27、厌氧硝酸盐产气

在厌氧情况下，有些好氧细菌，能以硝酸盐代替分子氧作为受氢体，进行厌氧呼吸，将硝酸盐还原为气态氮，即为土壤中的反硝化作用。某些芽孢杆菌，假单胞菌及产碱菌等属的细菌具有此反应。

接种封油：以斜面菌种用接种环接种后，用凡士林油（凡士林和液体石蜡为1：1）封管，封油的高度约1厘米。必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。

观察结果：培养2－7d，观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。如有气泡产生，表示反硝化作用产生氮气，为阳性反应。但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡，则只能按可疑或阴性处理。

28、马尿酸盐水解试验

本试验作为区分某些芽孢杆菌的鉴定和黄单胞菌属的鉴定之用。

接种和观察结果：

以幼龄菌种接种于上述培养液中，适温培养4周（高温芽孢菌培养2周），取1mL培养物，和1.5mL50％的；硫酸混合，静置片刻，在酸性混合物中有针状结晶出现为阳性，证明从马尿酸盐形成安息香酸。

29、对叠氮化钠的抗性

本试验用于高温芽孢杆菌的测定。

接种和观察结果：

取1环幼龄的菌液，接种于上述培养基中，同时接种营养肉汤作为对照。45℃培养7至14d观察生长情况。

30、氰化钾试验

氰化钾（KCN）是呼吸链末端抑制剂。能否在含有氰化钾的培养基中生长，是鉴别肠杆菌科各属常用的特征之一。

接种和观察结果：

用幼龄菌种接种于加氰化钾的测定培养基和未加氰化钾的空白培养基中，适温培养1－2d，观察生长情况。

能在测定培养基上生长者，表示氰化钾对测定菌无毒害作用，为阳性。若在测定培养基和空白培养基上均不生长，表示空白培养基的营养成分不适于测定菌的生长，必须选用其它合适的培养基。而测定菌在空白培养基上能生长，在含氰化钾的测定培养基上不生长，为阴性结果。

应该注意：氰化钾是剧毒药品，操作时必须小心。培养基用毕，每管加几粒硫酸亚铁和0.5mL20％KOH以解毒，然后清洗。

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31、对溶菌酶抗性的测定fficeffice" />

在100mL的三角瓶中，放入60－65mL无菌的0.01mol/L HCL，在其中加入0.1g溶菌酶，瓶上塞无菌棉花，在小火上煮沸20分钟后，冷到室温，加无菌的0.01mol/L HCL补足到100mL。取1mL溶菌酶溶液与99mL无菌的肉汤培养液混合，分装无菌试管，每管2.5mL，在含有0.001％溶菌酶肉汤管子及无溶菌酶的营养肉汤对照管中，各接种1环菌液，适温培养5－7d，记录两管的生长情况。

32、在pH5.7营养肉汤上的生长

本试验应用于芽孢杆菌属中种的鉴定。

接种和观察结果：

取菌液一环，接种于上述培养基中，同时接种普通肉汤液（7.2pH）作对照。适温培养1－3d后观察生长情况。

该培养液要求十分澄清，pH必须准确，最好用pH计调测。

33、需氧性试样

若在培养基中加入还原剂，如巯基醋酸钠和甲醛次硫酸钠等，以除去培养基中的氧气或氧化型物质，使厌氧菌能在有氧情况下生长。

1．接种与观察结果：用1小环（外径1.5毫米的接种环）的肉汤菌液，穿刺接种到上述培养基中，必须穿刺到管底。30℃培养，分别在3至7天观察结果。如细菌在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。

34、明胶（Gelatin）液化试验

　　有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。

　　试验方法：挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10~20min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。

35、淀粉水解试验

　　某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

　　试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20°培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。

　　淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。

36、生长温度的测定

细菌生长的最高、最适和最低温度，常常是某些细菌鉴定的特征之一。测定细菌的生长温度，要求培养液十分清晰（如普通肉汤培养液），并采用液体菌种直针接种（不用接种环接种）。放置于恒温水浴培养。指示温度计应放在同样的试管和培养基内，在指定温度下培养2－5d，观察生长情况。在接近0℃的低温培养，则观察时间可延长至7－10d，甚至30d。

观察记录结果：

目测生长情况，与未接种的空白培养基对比，注意混浊度、沉淀物和悬浮物等项，并分级记录如下：

（1）“＋“：表示生长良好；与对照管相比，可清楚地判定是混浊的。

（2）“＋－“：表示生长差；与对照管相比，只有在某一观察角度时方能看到明显的混浊。

（3）“－“：表示不生长；在适宜的角度下观察，与对照无差异。

总之，培养5d，能生长者均按生长计，否则按不生长计，凡培养5d仍属可疑者或不生长者必须重测，在重测时，可能出现有时生长，有时不生长的不稳定现象，这可能有两种原因：一种是水浴温度不稳定，培养时温度波动大；另一种原因可能是所测定的温度，恰好是测定菌的临界生长温度，在这种情况下，可用提高一度或降低一度的办法肯定之。

必须注意，当测定的试管较多时，不可将试管捆成一捆浸于水浴中，这样捆着的试管内外温度不一致，易出现误差。最好用特制试管架放试管，所用温度计应用标准温度计标定过。

37、形成芽孢的培养基

形成芽孢是芽孢杆菌的关键性特征，但不是所有的芽孢杆菌都能在任何条件下形成芽孢。在鉴定细菌时，为了确定是否属芽孢菌，需要对那些在一般条件下不形成芽孢的细菌，采用生孢子培养基，来确定是否能形成芽孢。

38、O/129的敏感性试验

O/129即2，4－二氨基－6，7－二异丙醇喋啶，为弧菌抑制剂。该试验用于弧菌属、气单胞菌属和假单胞菌属的鉴定。

取2，4－二氨基－6，7－二异丙醇喋啶150mg，溶于10mL1：1的乙醇：二乙基乙醚中。把6mm大小的滤纸片浸入该溶液后取出，在空气中晾杆，然后放在带菌的半固体培养基上做扩散敏感试验。

三、血清学试验

　　血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。

　　血清学反应的一般特点：

　　1)抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。

　　2)抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。

　　3)抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。

　　4)血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。而且，在第二阶段反应中，电解质、PH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。

　　习惯上将经典的血清学反应分三种类别：凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。

１、凝集反应

　　颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（Agglutination reaction）。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。

　　１）直接凝集反应

　　颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应，称为直接凝集反应(Direct agglution reaction)。

　　a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便，但不能进行定量测定。

　　b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。因为要测定抗体的含量，故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小时观察，血清最高稀释度仍有明显凝集现象的，为该抗血清的凝集效价。

　　２）间接凝集反应

　　将可溶性抗原（抗体）先吸附在一种与免疫无关的，颗粒状微球表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在有电解质存在的条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应(Indirect agglutination)。由于载体增大了可溶性抗原的反应面积。当载体上有少量抗原与抗体结合。就出现肉眼可见的反应，敏感性很高。

２、沉淀反应

　　可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。

　　１）环状沉淀反应：是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。

　　２）絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。

　　３）琼脂扩散试验：利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。单向扩散是一种定量试验。可用于免疫蛋白含量的测定。而双向扩散多用于定性试验。由于方法简便易行，常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。

３、补体结合反应

　　补体结合反应(Complement fixation reaction)是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象，如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。因此，整个试验需要有补体、待检系统（已知抗体或抗原、未知抗原或抗体）及指示系统（绵羊细胞和溶血素）五种成份参加。其试验原理是补体不单独和抗原或抗体结合。如果出现溶菌，是补体与待检系统结合的结果，说明抗原抗体是相对应的，如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应。此反应操作复杂，敏感性高，特异性强，能测出少量抗原和抗体，所以应用范围较广。

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完毕

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二、生理生化试验

　　微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

微生物检验中常用的生化反应有：

1、尿素酶（Urease）试验

　　有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。

　　试验方法：挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于36±1℃培养10，60和120min，分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。

2、氧化酶（Oxidase）试验

　　氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。

试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。

注意事项：

（1）                盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。

（2）                铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。

（3）                在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。

3、过氧化氢酶的测定

过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解水和氧。

1．试剂：3－10％过氧化氢（H₂O₂）

2．菌种培养：将测试菌种接种于合适的培养基斜面上，适温培养18－24h。

3．试验方法：取一干净的载波片，在上面滴1滴3－10％的H₂O₂，挑取1环培养18－24h的菌苔，在H₂O₂溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。也可将过氧化氢溶液直接加入斜面上，观察气泡的产生。

4．注意事项：过氧化氢酶是1种以正铁血红素作为辅基的酶，所以测试菌所生长的培养基不可含有血红素或红血球。

4、甲基红（Methyl Red）试验

　　肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。

　　试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于MR－VP生化鉴定管，于36通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。

　　甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4~6.0，其pK值为5.0。故在pH5.0以下，随酸度而增强黄色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。

5、V-P试验

　　某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。

　　试验方法：

　　１）O^’Meara氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养48h，培养液1ml加O^’Meara试剂（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液）1ml，摇动试管1~2min，静置于室温或36±1°C恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在48~50°C水浴放置2h后判定结果者。

　　２）Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入5°Cα萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。

　　３）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。

本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。

6、含碳化合物的利用

细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一碳源，反映该菌是否产生代谢这种化合物的有关酶系，因而作为鉴定依据。测定的基础培养基配方很多，因种而异。现介绍1种合成的基础培养基，有些细菌还可适当补加各种维生素。培养基可制成液体，分装试管，也可制成固体平板。可用于测定的底物种类很多，有单糖、双糖、糖醇、脂肪酸、羟基酸及其他有机酸、醇、各种氨基酸类胺类以及碳氢化合物等。糖的含量一般为1％，醇类酚类等的含量一般为0.1－0.2％，氨基酸的含量一般为0.5％。因碳氢化合物不溶于水，可在液体培养基中振荡培养，或加入到45℃的固体培养基中，振荡后立即倒成平板。有些底物不宜用高压灭菌，可用过滤法灭菌后加入已灭菌的基础培养基中，某些醇类和酚类不必灭菌。

接种和观察结果：菌种最好做成悬液，避免带入少量碳源干扰试验结果。平板培养用接种环点种，液体培养则用直针接种。每一测定菌必须接种未加碳水化合物的空白基础培养基作对照。

适温培养2、5、7天后观察，凡测定菌在有碳水化合物的培养基中生长情况，明显超过空白培养基的生长量为阳性，否则为阴性。假若两种培养基上生长情况差别不明显，开在同一培养基上连续移种3次，如差别仍不明显则以阴性论。

7、葡萄糖的氧化发酵试验

在细菌鉴定中，糖类发酵产酸是1项重要依据。细菌对糖类的利用有2种类型：1种是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最终受氢体，称发酵型产酸；另一种则以分子氧作为最终受氢体，称氧化型产酸。前者包括的菌种类型为多数。氧化型产酸量较少，所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和，而不表现产酸。为此，Hugh和Leifson提出一种含有低有机氮的培养基，用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵型产酸。这一试验广泛用于细菌鉴定。一般用葡萄糖作为糖类代表。也可利用这一基础培养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力。

（1）接种 ：以18－24h的幼龄菌种，穿刺接种在上述培养基中，每株菌接4管，其中2管用油封盖（凡士林：液体石蜡＝1：1混合后灭菌），约加0.5－1厘米厚，以隔绝空气为闭管。另2管不封油为开管，同时还要有不接种的闭管作对照。适温培养1、2、4、7天观察结果。

（2）结果观察：氧化型产酸――仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱（1－2d），后来才稍变酸。发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。

8、糖或醇类发酵试验

　　不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。

　　试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。

本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。

注：对于糖醇类发酵现在一般用糖、醇类细菌微量生化鉴定管在36℃18－24h即可出结果。

9、硝酸盐（Nitrate）还原试验

　　有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。

　　试验方法：临试前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。

　　用α-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。

10、靛基质（Imdole）试验

　　某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。

　　试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。

　　实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。

zhanggg709

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蝈蝈

 

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革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G⁺）和革兰氏阴性菌（G^—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。

该染色法所以能将细菌分为G⁺菌和G^—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G^—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G⁺菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色

步骤：

（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。

（2）晾干：与简单染色法相同。

（3）固定，与简单染色法相同

（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。

（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。

（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。

（7）水洗：用水洗去碘液。

（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。

（9）复染：滴加蕃红复染5min。

（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。

（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。

（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

（13）实验完毕后的处理：

①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。

②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干

蝈蝈

 

Aseptic technique:

 

 

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蝈蝈

 

Pour plate

 

Spread plate

zhanggg709

知道了